烟草β—1，3—葡聚糖酶的特性和结构分析

刘彪　杨柳 罗万麟　赵爽　殷雪艳

摘要 [目的]对烟草β-1，3-葡聚糖酶的特性和结构进行分析。[方法]以烟草为材料，采用PROTSCALE、TargetP 1.1、NPSA-PRABI和SWISS-MODEL工具分别测定烟草葡聚糖酶的疏/亲水性、亚细胞定位、二级结构和三级结构。[结果]NtBGl属于亲水性蛋白，NtBGl-1和NtBGl-2的疏/亲水性较为相似，N端和中部区域的疏水性较强，NtBGl-3以N端的疏水性较强；NtBGl均含有信号肽，且其切割位点分别位于第21、32和29位氨基酸处，NtBGl-1和NtBGl-2定位于液泡，NtBGl-3定位于细胞外；NtBGl的二级结构均以α-螺旋比例最大，依次为36.21%、35.14%、35.28%，三级结构呈现“C”型。[结论]该研究可为有效发挥烟草葡聚糖酶的功能特性奠定基础。

关键词 烟草；β-1，3-葡聚糖酶；结构；特性

中图分类号 S572 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）18-0076-03

Characterization and Structure Analysis of Tobacco β1，3Glucanase

LIU Biao， YANG Liu， LUO Wanlin et al

（Liangshan Tobacco Company， Xichang，Sichuan 615000）

Abstract [Objective]To study the characteristics and structure of tobacco β1，3glucanase.[Method]Tobacco was used as test material， PROTSCALE， TargetP 1.1， NPSAPRABI and SWISSMODEL tools were used to determine the hydrophile/hydrophilicity， subcellular location， secondary structure and tertiary structure of tobacco glucanas. [Result] NtBG1 belonged to the hydrophilic protein， NtBGl1 and NtBGl2 had similar sparse/hydrophilic properties， Nterminal and central region had strong hydrophobic， NtBGl3 only had hydrophobicity at Nterminal. NtBGl contained a signal peptide with cleavage sites at amino acids 21， 32 and 29， NtBGl1 and NtBGl2 localized to the vacuole， and NtBGl3 localized outside the cell. The secondary structure of NtBGl in alpha helix proportion was the largest， followed by 36.21%， 35.14%， 35.28%， The tertiary structure showed “C” type.[Conclusion]The study can lay a foundation for playing the functional properties of tobacco glucanase.

Key words Tobacco；β1，3glucanase；Structure；Characteristics

β-1，3-葡聚糖酶具有兩种重要的功能[1]，一种为降解植物细胞壁，促使植物体软化[2]，另一种为病原微生物入侵时，体内葡聚糖酶的含量和活性增加，从而抵抗真菌和细菌的入侵[3-5]。植物葡聚糖酶的含量和活性增加，不仅可以依靠外来微生物的入侵，还可以通过外源植物激素，如水杨酸和乙烯等[6-8]，进而增加植物的抗性。研究表明，根据植物葡聚糖酶的定位和功能特性，葡聚糖酶被划分为四类：碱性葡聚糖酶（定位于液泡）、酸性葡聚糖酶（定位于胞间隙）、胞外诱导型和胞外非诱导型葡聚糖酶[9]，碱性葡聚糖酶具有破坏并降解病原菌细胞壁的作用[10]，而酸性葡聚糖酶无抑制病菌的活性[11]。目前，对于烟草葡聚糖酶的研究主要为烟草相关病原微生物与葡聚糖酶的关系[12-15]。笔者通过生物分析法，更深次地研究烟草葡聚糖酶的序列特性，以期为有效发挥烟草葡聚糖酶的功能特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 筛选烟草β-1，3-葡聚糖酶家族成员

采用PROTEIN[16]数据库在线检索，筛选烟草葡聚糖酶相关的蛋白序列，获取的登录号分别是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1，依据优势氨基酸和氨基酸数进行命名，分别为NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[17]。

1.2 方法

采用Hphob./ Kyte & Doolittle法，且利用线性的重量变化模型，以PROTSCALE工具[18]测定烟草葡聚糖酶序列的疏/亲水性；使用TargetP 1.1的在线服务[19]，获取烟草葡聚糖酶的亚细胞结构及其相关数据；采用NPSA-PRABI工具[20]，测定烟草葡聚糖酶的二级结构，其Similarity threshold值为8，构象类型为4；使用SWISS-MODEL工具[21]，根据同源相似原理，构建烟草葡聚糖酶的三级结构。

2 结果与分析

2.1 烟草β-1，3-葡聚糖酶的疏/亲水性分析

由图1可知，NtBGl-1和NtBGl-2疏/亲水性较为相似，含有相同的最大值（2.956）甘氨酸，即疏水性相对较强，但位置不同，NtBGl-1的最大值位于第8位甘氨酸，而NtBGl-2位于第19位甘氨酸，此外，NtBGl-1和NtBGl-2含有相同的最小值（-2.833）精氨酸，即亲水性相对较强，NtBGl-1的最小值位于第231位精氨酸，NtBGl-2位于第242位精氨酸，2组序列均以N端和中部区域的疏水性较强，整体的疏/亲水性值分别为-0.112和-0.137，则NtBGl-1和NtBGl-2均为亲水性蛋白；NtBGl-3以第18位甘氨酸值最大（3.356），即疏水性相对较强，以第317位天冬酰胺的最小（-2.500），即亲水性相对较强，且该序列仅以N端的疏水性较强，整体的疏/亲水性值为-0.113，则NtBGl-3属于亲水性蛋白。综上所述，NtBGl的各成员均属于亲水性蛋白，且疏水区域为N端。

2.2 烟草β-1，3-葡聚糖酶的亚细胞定位和二級结构分析

为明确NtBGl属于4种类型的哪几种，以及在特定的亚细胞中发挥作用，依据氨基酸序列的信号肽对NtBGl进行亚细胞定位。由表1可知，序列长度为359 aa的NtBGl-1，在第21位存在切割位点（概率为0.967），根据信号肽判断NtBGl-1可能定位于液泡或细胞外，但定位于液泡的分值（4.0）大于细胞外（1.0），因此NtBGl-1定位于液泡；NtBGl-2的序列长度为370 aa，于第32位处存在切割位点（概率为0.838），定位于液泡内，其可靠性相对较低，级别为2；NtBGl-3定位于细胞外，其切割位点位于343 aa的第29号，概率最大（0.991），且级别为1。NtBGl二级结构在一定程度上决定高级结构，影响蛋白序列的功能，为此，对NtBGl序列的无规则卷曲、β-折叠、β-转角和α-螺旋组成含量进行分析。由图2可知，NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3的无规则卷曲分布无规律可寻，其所占比例依次为31.75%、33.78%、31.78%；NtBGl-1和NtBGl-2的β-折叠相对集中，而NtBGl-3较为分散，所占比例依次为21.73%、21.35%、20.12%；β-转角于整个序列中

所占的比例最小，依次为10.31%、9.73%、12.83%；NtBGl-1和NtBGl-2的α-螺在序列中表现为每隔50个氨基酸出现1次较为集中的α-螺序列，而NtBGl-3仅表现在中间和C端区域，NtBGl的α-螺所占比例最大，分别为36.21%、35.14%、35.28%。

2.3 烟草β-1，3-葡聚糖酶的三级结构分析

经Blast和HHBlits的同源比对方法，依据NtBGl的氨基酸序列，检索SWISS-MODEL的三级结构数据库，经筛选，以巴西橡胶树的糖基化β-1，3-葡聚糖酶的晶体结构和马铃薯内切-1，3-β-葡聚糖酶为模板（其模板序列分别4hpg.1和4gzi.1），构建NtBGl的三级结构，结果如图3。NtBGl-1和NtBGl-2依据巴西橡胶树的糖基化β-1，3-葡聚糖酶的晶体结构，构建三级结构，其中NtBGl-1以0.87%的覆盖率和63.78%的相似度获得其三级结构，含有的β-折叠、β-转角和α-螺旋数依次为22、30和16个；NtBGl-2的覆盖率为0.84%，其相似度为64.10%，二级结构数与NtBGl-1相同；NtBGl-3依据马铃薯内切-1，3-β-葡聚糖酶构建三级结构，覆盖率和相似度均最大，分别为0.92%和79.30%，β-折叠、β-转角和α-螺旋数分别为21、33和17个；NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3的三级结构均表现为“C”型，因此，NtBGl通过中间的功能域参与相应的生理反应。

3 结论与讨论

NtBGl的各成员均属于亲水性蛋白，且疏水区域为N端，有利于NtBGl形成跨膜结构，锚定于特定的质膜上发挥作用[22]；NtBGl-1和NtBGl-2均定位于液泡中，表明该蛋白属于碱性β-1，3-葡聚糖酶，即该蛋白可能参与降解病原菌菌丝，增加植物的抗性[23]，NtBGl-3属于酸性β-1，3-葡聚糖酶[9]；NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3的二级结构均以α-螺旋的比例最大，有利于保证三级结构的稳定[17]；NtBGl的三级结构表现为“C”型，说明该酶的催化活性区可能位于空间结构的凹陷处。

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