兔脑炎原虫性脑肉芽肿形成与PI3K/AKT信号通路的关系

潘耀谦，李瑞珍，郭东光，李雪华，李 鹏，岳 峰，张艳芳，刘金宵，王选年，刘兴友

(新乡学院 生命科学和基础医学学院,河南 新乡 453003 )

兔脑炎原虫病是由兔脑炎原虫所引起的一种人畜共患的寄生虫病。兔脑炎原虫是一种专性细胞内寄生的微孢子虫，是最普通和最重要的动物病原[1-3]。近年来，国内许多学者运用生物技术在我国的许多动物体内检出了肠型微孢子虫或兔脑炎原虫，证明脑炎原虫在我国的感染还很严重。据报道，在我国西南地区的马、猪、宠物和花栗鼠等动物体内检出了兔脑炎原虫和肠型微孢子虫[4-5]；在我国的西藏猪、新疆猪和海南猪体内也检出了肠型微孢子虫[6-8]。LI等[9]在我国的绵羊和山羊体内检出了肠型微孢子虫。QIU等[10]发现,我国感染兔脑炎原虫的动物除兔外，还有牛、犬、猪、羊和鹿等，其感染率分别为20%，7.8%，45.1%，28.1%和19.3%。大脑是脑炎原虫侵害的主要靶器官，以形成脑肉芽肿为特点[11-14]。脑肉芽肿的形成是脑内炎性细胞，特别是巨噬细胞的浸润和脑组织细胞成分，如星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞增生的结果。迄今为止，人们对脑炎原虫性脑肉芽肿形成的机理还不清楚。据报道，PI3K /AKT信号转导通路作为细胞生存的信号通路之一，在细胞增殖、分化,肿瘤形成和抑制细胞凋亡等方面均起重要的作用[15-16]。为了研究脑炎原虫性脑肉芽肿形成与PI3K /AKT信号通路的关系，故拟进行本试验。

1 材料与方法

1.1 试验动物和脑组织处理本试验用抗兔脑炎原虫间接ELISA检测法对40只具有神经症状的病兔和10只健康兔进行了血清学检查，结果显示：40只病兔呈阳性反应，患脑炎原虫病；而10只健康兔呈阴性反应，可用作对照兔。受试兔分别用乙醚安乐死后，剖检后对脑组织进行了分解采样。将样品分别放入-80℃冰箱保存做蛋白提取，或用4%多聚甲醛固定制作组织切片，详细操作见参考文献[17]。

1.2 普通染色和特殊染色为了详细检查病兔脑组织中的基本病变和一些特殊变化，在用苏木精-伊红(HE)染色的基础上，又用改良的革兰染色法(MGS)、甲基绿派若宁染色法(MBPS)和美蓝染液等特殊染色液对脑组织进行了染色,并用光学显微镜进行了观察和记录。

1.3 抗PI3K/AKT信号通路关键蛋白的免疫组化染色PI3K/AKT信号通路关键蛋白的免疫组化染色的方法和步骤与参考文献[17]基本相同，不同的是一抗，分别为鼠抗兔VEGF抗体、P85抗体、P110抗体和AKT抗体(Santa Cruz公司生产)，使用时分别进行了500，50，100，50倍稀释。

1.4 Western blot检测本试验用Western blot技术对脑组织中PI3K/AKT信号转导通路关键蛋白的特异性表达进行了检测，使用的一抗分别为鼠抗兔VEGF抗体、P85抗体、P110抗体和AKT抗体(Santa Cruz公司生产)，使用时分别进行了5 000，2 000，2 000，5 000倍稀释。具体的染色操作步骤见参考文献[18].

1.5 数据分析用Gel-Pro Application软件对病兔与健康兔各种信号通路蛋白Western blot检测的积分光密度值进行了计算和比较，并采用GraphPad Prism 5软件作图、用SPSS 17.0处理数据和统计学分析。数据分析的结果表示为：**示P<0.01，差异极显著； *示P<0.05,差异显著；P>0.05示差异不显著。

2 结果

2.1 普通染色和特殊染色结果健康兔的脑组织不论是HE染色，还是MGS和MBPS等特殊染色均未检出任何病理变化。而病兔脑组织用HE染色时均可检出细胞性肉芽肿、增生性肉芽肿或坏死性肉芽肿等特异性脑炎原虫性病变。MGS染色时常在坏死性肉芽肿的坏死组织中检了出呈椭圆形或短杆状，个体较大的被染成蓝色的兔脑炎原虫。MBPS染色时多在巨噬细胞的胞浆中检出球形或豆点状呈红色的脑炎原虫。

2.2 免疫组化染色结果健康兔的脑组织切片用鼠抗兔VEGF、P85、P110和AKT抗体等各种抗信号通路蛋白的抗体进行免疫组织化学检测时，可在没有发生病理变化的脑组织中检出少量血管内皮细胞呈弱阳性反应，还有少量正常的星形胶质细胞也出现弱阳性变化，但脑组织中位于小血管外周的纤维细胞则呈阴性。病兔脑细胞的切片中检出特异性肉芽肿病变，而且脑肉芽肿形成细胞对各种抗PI3K/AKT信号通路抗体的免疫组化染色呈现强性性反应。

2.2.1anti-VEGF免疫组化染色观察 本染色的特点是在细胞性肉芽肿中，已形成的上皮样细胞和多核巨细胞呈强阳性反应，散在于上皮样细胞的周围的星形胶质细胞也呈强阳性反应，新生的血管内皮细胞呈强阳性反应，而淋巴细胞和神经元则呈阳性反应(图1A)。在增生性肉芽肿周围，见新生血管的内皮细胞呈强阳性反应，被染成深棕褐色。内皮细胞的胞核较明显，突入管腔，而上皮样细胞则呈则呈弱阳性反应(图1B)。在坏死性肉芽肿中上皮样细胞多呈阴性反应，而包绕肉芽肿的大量星形胶质细胞和少量成纤维细胞则呈强阳性反应。位于肉芽肿周围的神经元也呈阴性反应(图1C)。

A.细胞性肉芽肿，上皮样细胞和多核巨细胞(红箭头)及新的血管内皮细胞(黑箭头)呈阳性反应;B.增生性肉芽肿周围新形成的血管内皮细胞呈强阳性(箭头);C.坏死性肉芽肿周围散在的星形胶质细胞呈强阳性(黑箭头)，而成熟的上皮样细胞则呈阴性(红箭头)。图中标尺=100 μm,下同

2.2.2anti-P85免疫组化染色观察 在细胞性肉芽肿形成的初期，可见大量巨噬细胞和少量生的上皮样细胞呈强阳性，小血管周围的淋巴细胞和肉芽肿周围散有的神经元呈阴性(图2A)。随着病程的发展，增生性肉芽肿中的上皮样细胞呈弱阳性或阴性，而其周围的星形胶质细胞和新生的血管内皮细胞则呈强阳性(图2B)。坏死性肉芽肿中的上皮样细胞呈阴性，中心的坏死组织中有强阳性的星形胶质细胞，包绕坏死性肉芽肿周围的普通肉芽细胞，其中的成纤维细胞呈强阳性(图2C)。

A.细胞性肉芽肿中的巨噬细胞(红箭头)和上皮样细胞(黑箭头)呈强阳性;B.增生性肉芽肿周围的星形胶质细胞(红箭头)和新生的血管内皮细胞(黑箭头)呈阳性;C.坏死性肉芽肿周围的成纤维细胞呈强阳性(箭头)

2.2.3anti-P110免疫组化染色观察 在成熟的细胞性肉芽肿，可见巨噬细胞和大量的上皮样细胞呈阳性或强阳性，被染成深棕色，周围新生的毛细胞血管内皮细胞也呈阳性。肉芽肿周围的神经纤维脱髓鞘呈灰白色，神经元呈阴性(图3A)。在细胞性肉芽肿中大部分上皮样细胞呈弱阳性或阴性，而周围新生的毛细胞血管，其内皮细胞呈强阳性，特殊肉芽肿层外周的普通肉芽肿层中，大量星形胶质细胞呈强阳性(图3B)。坏死性肉芽肿中的上皮样细胞多呈阴性变化，在普通肉芽组织层中见大量星形胶质细胞和形状呈梭形的成纤维细胞出现强阳性反应，新生的毛细胞内皮细胞也呈阳性(图3C)。

A.细胞性肉芽肿中的巨噬细胞(红箭头)和上皮样细胞(黑箭头)呈强阳性；B.增生性肉芽肿周围的星形胶质细胞(红箭头)和小血管的内皮细胞(黑箭头)呈强阳性；C.坏死性肉芽肿的外周有大量呈强阳性的星形胶质细胞(红箭头)和梭形的成纤维细胞(黑箭头)

2.2.4anti-AKT和P-AKT免疫组化染色观察 anti-AKT和P-AKT的兔疫组化染色结果大致相同。在细胞性肉芽肿的初期，可见巨噬细胞和上皮样细胞呈强阳性，新生的血管内皮细胞呈阳性，肉芽肿周围散在的神经元呈阴性(图4A)。增生性肉芽肿中的上皮样细胞呈阳性或弱阳性反，而散在于肉芽肿周围的星形胶质细胞则呈强阳性反应，新生的血管上皮也呈强阳性(图4B)。在坏死性肉芽肿周围常见大量毛细胞血管和小血管形成，其上皮细胞多呈强阳性反应，而坏死组织周围的上皮样细胞则呈阴性，位于坏死性肉芽肿周围的淋巴细胞和神经元也呈阴性反应(图4C)。

A.细胞性肉芽肿中的巨噬细胞(红箭头)和上皮样细胞呈强阳性(黑箭头)；B.增生性肉芽肿周围新生毛细胞血管内皮呈强阳性(黑箭头)，星形胶质细胞也呈强阳性(红箭头)；C.坏死性肉芽吸周围新生的小血管内皮呈强阳性(箭头)

2.3 Western blot检测的结果用Western blot对患脑炎原虫病兔与正常对照兔脑组织的几种关键性PI3K/AKT信号转导通路蛋白的检测，结果观察到病兔脑组织中的VEGF、P85、P110、AKT和p-Akt的表达量均明显高于对照兔。直观Western blot检测的结果，病兔的VEGF、P85、P110、Akt和p-Akt的蛋白条带明显比对照兔的粗大，着色也较深。其中以VEGF和p-Akt的含量最高，蛋白条带清晰度最好。另外AKT蛋白条带中具有明显的二聚体表达，P110蛋白条带也有较明显的二聚体变化。正常对照兔脑组织中的VEGF、P85、P110、Akt和p-Akt蛋白含量明显低于病兔，蛋白条带很淡，特别是VEGF条带，几乎用肉眼无法辨认(图5)。

1～4.病例号；C.对照

经对Western blot检测结果的积分光密度值测定、数据处理和统计分析，证明病兔脑组织中的PI3K/AKT信号转导通路的关键蛋白的表达量明显高于对照兔(P<0.01，差异极显著)。再经直接观察和积分光密度值测定Western blot检测结果，证明病兔脑组织中PI3K/AKT信号通路中关键性蛋白的表达量以VEGF和p-Akt最高，其次为AKT,P110和P85(图6)。这一结果说明VEGF的激活作用和激活的p-Akt在PI3K/AKT信号通路中发挥重要的作用。

1～4.病例号；C.对照

3 讨论

3.1 PI3K/AKT信号转导通路对脑肉芽肿形成的影响据报道，PI3K/AKT信号转导通路在细胞的代谢、生长、增殖、存活、转录、蛋白质合成和肿瘤生长等方面发挥着重要作用，而兔脑炎原虫引起的脑肉芽肿形成就是经细胞分化、生长和增生为主的变化过程[19-21]。因此，本研究对脑炎原性脑肉芽肿组织形成的脑组织中的几种PI3K/AKT信号转导通路关键蛋白VEGF、P85、P110、AKT 和P-AKT进行了检测，发现用免疫组织染色时，这几种关键蛋白在增重的巨噬细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和上皮样细胞均呈强阳性反应。用Western blot检测时，病兔脑细胞中这几种关键蛋白明显高于对照兔的脑组织，差异很显著，说明PI3K/AKT信号转导通路在脑肉芽肿形成过程中起到了促进作用。据报道[16，22]，PI3K既有脂类激酶活性，又有蛋白激酶的活性，是PI3K/AKT信号转导通路被激活的关键。当脑组织受损可释放出VEGF等一些具有酪氨酸激酶活性受体激活的物质，从而将PI3K激酶激活。PI3K激酶主要由调节结构域P85和催化结构域P110构成。激活PI3K激酶可使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成第二信使 PIP3，PIP3再与Akt的PH结构域结合，在使Akt从细胞质向细胞膜转位的同时，又能够改变其构象，使其由抑制状态变为激活状态。Akt磷酸化激活后即成为p-Akt，后者可通过直接将凋亡相关蛋白磷酸化或者间接改变、编码凋亡相关蛋白的基因表达水平，抑制凋亡基因的表达，从而实现调控多种生长因子来诱发细胞生长、促进细胞存活的生物学效应。由此可见，在病兔脑组织中检测到信号通路关键蛋白的变化，与PI3K/AKT信号转导通路的变化基本是相同的，说明PI3K/AKT信号转导通路与兔脑炎原性脑肉芽肿的形成有密切的关系。

3.2 PI3K/AKT与ERK和PLCγ/PKC信号转导通路与脑肉芽肿形成的关系众所周知[23-24]，PI3K/AKT信号转导通路和ERK及PLCγ/PKC信号转导通路组成受体酪氨酸蛋白激酶信号转导通路，主要由50多种受体组成的超家族，其共同的结构特点是单次跨膜，胞内区含有受体酪氨酸蛋白激酶，配体以生长因子为主。受体酪氨酸蛋白激酶信号转导通路可分为以下3个分支：即Ras/Raf/MEK/ERK(简称ERK)、PLCγ/PKC和PI3K/AKT信号转导通路，均与细胞的分化、生长、代谢、增殖和抑制凋亡有关。兔脑炎原虫性脑肉芽肿的形成，实际上是一种以细胞的代谢增强、分裂增速、增殖加快，在脑炎原虫存在的脑细胞中以包围病原为目的而形成的防御细胞团块，这说明了脑肉芽肿的形成与受体酪氨酸蛋白激酶信号通路有关。因此，我们曾对ERK信号转导通路中神经生长因子(NGF)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)等4种关键性蛋白进行研究[25]，发现NGF、TPK、MAPK和ERK在肉芽肿中的星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞中强阳性免疫反应，染成深棕色；这几种关信号通路关键蛋白丰度在病兔脑组织中明显高于健康兔，表明ERK信号转导通路通过强大的级联反应参与了兔脑炎原虫性脑肉芽肿的形成。继之，又对脑炎原虫性脑肉芽肿形成与PLCγ/PKC信号转导通路中成纤维细胞生长因子(FGF)、磷酯酶Cγ(PLCγ)、磷酸化的磷酯酶Cγ(P-PLCγ)和蛋白激酶C(PKC)等关键性蛋白的关系进行了研究[26]，发现FGF、PLCγ、P-PLCγ和PKC的表达在肉芽肿的星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞中明显增高，呈强阳性反应，病兔脑组织中的FGF、PLCγ、P-PLCγ和PKC等信号转导通路关键蛋白表丰度明显高于健康兔。结果表明，PLCγ/PKC信号转导通路通过强大的级联反应参与了兔脑炎原虫性脑肉芽肿的形成。本次通过对PI3K/AKT信号转导通路VEGF、P85、P110、AKT 和P-AKT关键蛋白进行检测，结果与前2个信号通路的基本相同。由此可见，兔脑炎原虫脑肉芽肿的形成与受体酪氨酸蛋白激酶信号转导通路激活有关。

3.3 PI3K/AKT与ERK和PLCγ/PKC信号转导通路促进脑肉芽肿各细胞成分增殖众所周知，参与受体酪氨酸蛋白激酶信号通路的酶类和蛋白质众多，但每条主要信号通路的关键蛋白还是比较固定的[19.21.25-26]。我们先后对受体酪氨酸蛋白激酶的3条次级信号通路中13种关键蛋白进行了检测[23-24]，发现它们与脑炎原虫脑肉芽肿形成的细胞之间有密切的关系，并有一定的规律可寻。一是形成特异性脑肉芽肿的细胞，对13种关键蛋白检测的变化是动态的，当细胞处于分裂增殖时常呈强阳性反应，处于平稳阶段时则呈现弱阳性或阴性反应。如在肉芽肿的初期，即细胞性肉芽肿时，聚集的巨噬细胞、新分裂形成的上皮样细胞、星形胶质细胞和新生的皮管内皮细胞均强阳性反应。而当其转变为增生性肉芽时，巨噬细胞转化为上皮样细胞，且增生变慢或停止，这时的上皮样细胞对各种关键蛋白的检测就出现弱阳性或阴性反应。这说明当肉芽肿中的一些细胞成熟不再增生时，信号通路的关键蛋白激活就停止了。与之相反，一些在细胞性肉芽肿中没有出现的细胞，而在坏死性肉芽肿形成过程中增生明显的细胞，如成纤维细胞呈现强阳性反应，被染成棕褐色。而另一些细胞，如星形胶质细胞和血管内皮细胞，从细胞性肉芽肿到坏死性肉芽肿形成过程中一直处于增生状态，所以这些细胞一直呈现明显的阳性反应。二是只要肉芽肿中的细胞成分处于分裂和增殖阶段，用13种关键信号通路蛋白染色时均呈阳性反应。这说明细胞膜表面的受体种类是非常多的，只要处理增殖阶段的细胞，一些似乎与之不适应的激活因子，如血管内皮因子(常被认为是仅存在血管内皮膜上，是引起血管内皮增生的特殊因子)，也可以作用于其膜上的受体激活细胞信号转导通路，引起细胞分裂和增殖。

总之，通过用3条信号通路中抗13种关键蛋白的免疫组化染色，发现兔脑炎原虫性脑肉芽肿中增生的细胞成分，在不同时期的增殖阶段多呈阳性反应，说明受体酪氨酸蛋白激酶通路中的3条信号通路均参与了脑肉芽肿的形成。这一复杂的相互作用的级联反应，促使脑炎原虫性脑肉芽肿从细胞性、增生性到坏死性肉芽肿的转化，成为兔脑炎原虫性脑损伤的特殊病变。