高原习服黄牛脑组织不同部位SLC25A6 mRNA绝对定量分析

王志强+俞红贤+荆海霞+张勤文+魏青+梁林+牛亮

摘要：为研究SLC25A6 mRNA在高原习服黄牛脑组织中的表达量对能量利用的影响，建立用于SLC25A6基因绝对定量的标准曲线；标准曲线扩增效率为E=104.9%，回归系数r值为-0.996，斜率为-3.210，溶解曲线峰值单一；绝对定量检测值表明，高原习服黄牛脑组织各部位SLC25A6 mRNA表达量总体差异有统计学意义，SLC25A6 mRNA检测值从高至低依次为小脑、海马、枕叶、额叶、颞叶、顶叶，小脑SLC25A6基因表达量显著高于其他各组织；顶叶表达量最低，小脑表达量为顶叶表达量的2.79倍；额叶、颞叶、顶叶之间差异，枕叶、海马之间差异均无统计学意义。结果表明，高原习服黄牛脑组织中小脑耗能强度可能最大，细胞活动旺盛；相反顶叶耗能强度最低。

关键词：高原习服黄牛；脑组织；线粒体；SLC25A6基因；ANT3；绝对定量

中图分类号：S852.16+1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0039-03

青藏高原平均海拔在4 500 m左右，大气压及氧分压较低，高寒干燥、紫外辐射强度大，特殊的地理及气候条件造就了特殊的生态环境；由于独特的高原环境长期影响，使得土著动物及人类在机体各个方面形成了对高原环境的低氧适应。机体获取的氧气最终通过线粒体被利用，糖类、脂肪、氨基酸在细胞质基质中完成糖酵解过程后，通过线粒体的三羧酸循环及氧化磷酸化途径，利用组织氧生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），从而为机体提供能量。

动物及人由低海拔地区进入高海拔地区后，机体会通过代偿等方式来适应低氧环境，从而减轻缺氧初期出现的症状，促使机体产生高原习服。研究表明，哺乳动物中枢神经系统对氧分压的改变极为敏感，脑组织不同区域会通过分子、细胞等各个水平的改变来适应低氧^[1]。但急性低氧暴露仍会损伤脑组织，造成神经细胞出现散在性坏死等现象^[2]。急性重复性低氧刺激可使脑组织线粒体功能受到抑制，同时提高脑组织ATP相对水平^[3]。低氧预适应能够减轻脑组织缺血后海马细胞凋亡数^[4]，提高线粒体的膜电位、减少线粒体活性氧及一氧化氮的产生^[5]，并通过降低线粒体通透性转变的概率来减少细胞凋亡数^[6]。

研究表明，线粒体内膜上的腺甘酸转运体（adenine nucleotide translocator，ANT）能够促进胞质和线粒体之间二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）与ATP的交换，使能量代谢顺利进行；而且ANT的4种异构体均与细胞凋亡途径有关^[7]，由SLC25A6基因编码的线粒体内膜蛋白ANT3表达量增高可引起线粒体膜通透性的改变，从而诱发细胞凋亡^[8-9]。

应用绝对定量的方法，对高原习服黄牛SLC25A6 mRNA在脑组织不同部位的表达情况进行研究，以期揭示低氧环境对高原习服黄牛脑组织不同部位能量代谢的影响，为哺乳动物低氧适应的分子机制及高原医学积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 动物来源及样品处理

于青海省海晏县（海拔3 000 m左右）选取临床健康成年高原习服黄牛，颈动脉放血致死后，迅速取大脑额叶、颞叶、顶叶、枕叶、海马及小脑皮层样本，将其置于液氮中低温保存，用于提取总RNA。

1.2 主要仪器与试剂

低温高速离心机、普通PCR扩增仪、核酸电泳仪、紫外凝胶成像仪、核酸蛋白检测仪、real-time PCR扩增仪；2×Taq PCR MasterMix（含染料）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PMD19-T Vector，均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNAsimple Total RNA Kti试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司、质粒DNA小量抽提试剂盒、EcoRⅠ，均购自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 设计并合成引物 通过美国国家生物技术信息中心查询普通牛（Bos taurus）SLC25A6基因的mRNA序列（NM_174660.2），根据其序列利用DNAMAN、Primer5设计特异性引物（表1），预计扩增目的基因片段长度为95 bp。引物设计后交由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 总RNA的提取及RT-PCR反应 利用RNAsimple Total RNA Kti试剂盒，按照说明书步骤，提取高原习服黄牛总RNA。

1.3.3 绝对定量标准品的制备

1.3.3.1 SLC25A6基因片段扩增 以反转录产物为模板进行PCR扩增反应，PCR反应加样体系如下：模板1 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O2 10.5 μL，Solarbio 2×Taq PCR MasterMix（含染料）12.5 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s，30个循环；72 ℃ 4 min充分延伸。产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3.2 克隆SLC25A6基因片段并验证 利用Solarbio 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物纯化，纯化产物与PMD19-T Vector在 16 ℃条件下连接1 h。后经42 ℃热击及冰浴等反应与E.coil DH5α感受态细胞进行连接，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素、半乳糖苷酶和异丙基硫代半乳糖苷的LB固体培养基平板上，37 ℃温箱中培养12 h。挑取白色阳性单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，振荡培养12 h。利用通用引物对菌液进行PCR初步鉴定后，对阳性转化子进行测序以进一步验证。

1.3.3.3 质粒DNA抽提、酶切及纯化 利用质粒DNA小量抽提试剂盒对鉴定正确的阳性菌液进行质粒提取。通过EcoRⅠ对抽提的质粒进行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。将酶切好的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并利用solarbio 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目标DNA条带进行回收纯化，从而去除酶切不完全的环状质粒。

1.3.3.4 质粒DNA浓度测定及梯度稀释 利用核酸蛋白检测仪对纯化后的线性质粒进行浓度测定。根据公式：质粒拷贝数（拷贝数/μL）=6.02×1023（拷贝数/mol） ×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（g/mol），得出质粒拷贝数，然后将质粒进行10倍梯度稀释，分别稀释成1×108～1×102拷贝数/μL的7个梯度，作为标准品。

1.3.4 real-time PCR反应 real-time PCR扩增反应的加样体系如下：模板2 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR扩增程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先将反转录产物cDNA上机后进行1个循环，使cDNA由单链变为双链，后与标准品一同进行40个循环。待测样品设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测结果

利用BIO-RAD核酸蛋白检测仪测定RNA纯度及浓度，测定结果见表2，各项指标均符合要求。凝胶电泳检测结果见图1，泳道自左至右以此为：额叶、颞叶、顶叶、枕叶、小脑及海马，18S及28S条带清晰，并无降解现象出现。

2.4 高原习服黄牛脑组织内SLC25A6基因mRNA表达量

通过反转录试剂盒进行反转录时，20 μL的反转录体系中共加入了1 μg的总RNA，而进行Real-time PCR时，反应体系中加入了2 μL反转录产物。根据标准曲线中CT值与基因拷贝数的关系，换算出SLC25A6基因在总RNA/μg中的绝对表达量。高原习服黄牛脑组织内SLC25A6基因mRNA表达量见表3、图5。高原习服黄牛脑组织中小脑SLC25A6基因表达量最高，拷贝数均值为3.683×107拷贝数/μg，显著高于其他各组织；顶叶表达量最低，小脑表达量为顶叶表达量的2.79倍；颞叶与枕叶、海马表达量均值之间有统计学意义；顶叶与枕叶、海马表达量均值之间有统计学意义；额叶、颞叶、顶叶均值之间差异，枕叶与海马之间差异均无统计学意义。

度地利用氧，并产生尽可能多的能量；脑组织的缺氧适应能够使损坏脑细胞的不良因素得到抑制或调整，使脑组织在不良环境下度过危险期^[10]。ANT在能量代谢中发挥着重要作用，本试验通过测定SLC25A6基因在高原习服黄牛脑组织中的表达情况，间接反映脑组织不同部位在高原低氧习服情况下对能量的利用情况。

由于反转录产物cDNA为单链，而标准品质粒为双链，所以进行Real-time PCR时，先将cDNA进行1个循环的扩增，使其变为双链，后与标准品一同进行40个循环，以避免单链与双链之间的差异^[11]。试验结果表明，标准曲线的扩增效率为E=104.9%，回归系数r=-0.996，斜率为-3.210，溶解曲线峰值单一。从这些参数可以看出标准曲线线性关系良好，引物特异性较强。结果能够真实反映出SLC25A6基因在高原习服黄牛脑组织中的实际拷贝数。

本研究结果表明，在高原习服黄牛脑组织中SLC25A6基因的表达量从高到低依次为小脑、海马、枕叶、额叶、颞叶、顶叶，小脑表达量显著高于其组织，小脑SLC25A6基因表达量为额叶表达量的2.79倍。顶叶消耗能量强度较低，细胞能量代谢较弱，小脑消耗能量强度较大，细胞能量代谢较强。可以推断顶叶为低氧环境敏感区域，小脑抗低氧能力较强。

参考文献：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴荣继，等. 常压低氧下Wistar大鼠脑组织中HIF-1α表达与脑损伤[J]. 化学通报，2010，73（11）：1030-1034.

[3]谢胜男，李 昕，李尧华，等. 急性重复低氧对小鼠脑组织血氧饱和度、线粒体功能以及ATP水平的影响[J]. 中国病理生理杂志，2008，24（4）：755-758.

[4]齐 晶，闵连秋.低氧预处理对缺血脑组织p53表达的影响[J]. 牡丹江医学院学报，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]兰春慧，房殿春，樊丽琳，等. 线粒体内膜蛋白ANT在幽门螺杆菌致胃癌细胞凋亡中的表达[J]. 胃肠病学和肝病学杂志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，吕国蔚. 脑缺氧和脑缺氧适应时能量代谢的变化[J]. 首都医科大学学报，1996，17（2）：153-155.

[11]李 丽，赵成萍，李 宏，等. 质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立[J]. 农业生物技术学报，2011，19（6）：1157-1162.

1.3.3.3 质粒DNA抽提、酶切及纯化 利用质粒DNA小量抽提试剂盒对鉴定正确的阳性菌液进行质粒提取。通过EcoRⅠ对抽提的质粒进行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。将酶切好的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并利用solarbio 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目标DNA条带进行回收纯化，从而去除酶切不完全的环状质粒。

1.3.3.4 质粒DNA浓度测定及梯度稀释 利用核酸蛋白检测仪对纯化后的线性质粒进行浓度测定。根据公式：质粒拷贝数（拷贝数/μL）=6.02×1023（拷贝数/mol） ×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（g/mol），得出质粒拷贝数，然后将质粒进行10倍梯度稀释，分别稀释成1×108～1×102拷贝数/μL的7个梯度，作为标准品。

1.3.4 real-time PCR反应 real-time PCR扩增反应的加样体系如下：模板2 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR扩增程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先将反转录产物cDNA上机后进行1个循环，使cDNA由单链变为双链，后与标准品一同进行40个循环。待测样品设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测结果

利用BIO-RAD核酸蛋白检测仪测定RNA纯度及浓度，测定结果见表2，各项指标均符合要求。凝胶电泳检测结果见图1，泳道自左至右以此为：额叶、颞叶、顶叶、枕叶、小脑及海马，18S及28S条带清晰，并无降解现象出现。

2.4 高原习服黄牛脑组织内SLC25A6基因mRNA表达量

通过反转录试剂盒进行反转录时，20 μL的反转录体系中共加入了1 μg的总RNA，而进行Real-time PCR时，反应体系中加入了2 μL反转录产物。根据标准曲线中CT值与基因拷贝数的关系，换算出SLC25A6基因在总RNA/μg中的绝对表达量。高原习服黄牛脑组织内SLC25A6基因mRNA表达量见表3、图5。高原习服黄牛脑组织中小脑SLC25A6基因表达量最高，拷贝数均值为3.683×107拷贝数/μg，显著高于其他各组织；顶叶表达量最低，小脑表达量为顶叶表达量的2.79倍；颞叶与枕叶、海马表达量均值之间有统计学意义；顶叶与枕叶、海马表达量均值之间有统计学意义；额叶、颞叶、顶叶均值之间差异，枕叶与海马之间差异均无统计学意义。

度地利用氧，并产生尽可能多的能量；脑组织的缺氧适应能够使损坏脑细胞的不良因素得到抑制或调整，使脑组织在不良环境下度过危险期^[10]。ANT在能量代谢中发挥着重要作用，本试验通过测定SLC25A6基因在高原习服黄牛脑组织中的表达情况，间接反映脑组织不同部位在高原低氧习服情况下对能量的利用情况。

由于反转录产物cDNA为单链，而标准品质粒为双链，所以进行Real-time PCR时，先将cDNA进行1个循环的扩增，使其变为双链，后与标准品一同进行40个循环，以避免单链与双链之间的差异^[11]。试验结果表明，标准曲线的扩增效率为E=104.9%，回归系数r=-0.996，斜率为-3.210，溶解曲线峰值单一。从这些参数可以看出标准曲线线性关系良好，引物特异性较强。结果能够真实反映出SLC25A6基因在高原习服黄牛脑组织中的实际拷贝数。

本研究结果表明，在高原习服黄牛脑组织中SLC25A6基因的表达量从高到低依次为小脑、海马、枕叶、额叶、颞叶、顶叶，小脑表达量显著高于其组织，小脑SLC25A6基因表达量为额叶表达量的2.79倍。顶叶消耗能量强度较低，细胞能量代谢较弱，小脑消耗能量强度较大，细胞能量代谢较强。可以推断顶叶为低氧环境敏感区域，小脑抗低氧能力较强。

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[3]谢胜男，李 昕，李尧华，等. 急性重复低氧对小鼠脑组织血氧饱和度、线粒体功能以及ATP水平的影响[J]. 中国病理生理杂志，2008，24（4）：755-758.

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[11]李 丽，赵成萍，李 宏，等. 质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立[J]. 农业生物技术学报，2011，19（6）：1157-1162.

1.3.3.3 质粒DNA抽提、酶切及纯化 利用质粒DNA小量抽提试剂盒对鉴定正确的阳性菌液进行质粒提取。通过EcoRⅠ对抽提的质粒进行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。将酶切好的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并利用solarbio 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目标DNA条带进行回收纯化，从而去除酶切不完全的环状质粒。

1.3.3.4 质粒DNA浓度测定及梯度稀释 利用核酸蛋白检测仪对纯化后的线性质粒进行浓度测定。根据公式：质粒拷贝数（拷贝数/μL）=6.02×1023（拷贝数/mol） ×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（g/mol），得出质粒拷贝数，然后将质粒进行10倍梯度稀释，分别稀释成1×108～1×102拷贝数/μL的7个梯度，作为标准品。

1.3.4 real-time PCR反应 real-time PCR扩增反应的加样体系如下：模板2 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR扩增程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先将反转录产物cDNA上机后进行1个循环，使cDNA由单链变为双链，后与标准品一同进行40个循环。待测样品设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测结果

利用BIO-RAD核酸蛋白检测仪测定RNA纯度及浓度，测定结果见表2，各项指标均符合要求。凝胶电泳检测结果见图1，泳道自左至右以此为：额叶、颞叶、顶叶、枕叶、小脑及海马，18S及28S条带清晰，并无降解现象出现。

2.4 高原习服黄牛脑组织内SLC25A6基因mRNA表达量

通过反转录试剂盒进行反转录时，20 μL的反转录体系中共加入了1 μg的总RNA，而进行Real-time PCR时，反应体系中加入了2 μL反转录产物。根据标准曲线中CT值与基因拷贝数的关系，换算出SLC25A6基因在总RNA/μg中的绝对表达量。高原习服黄牛脑组织内SLC25A6基因mRNA表达量见表3、图5。高原习服黄牛脑组织中小脑SLC25A6基因表达量最高，拷贝数均值为3.683×107拷贝数/μg，显著高于其他各组织；顶叶表达量最低，小脑表达量为顶叶表达量的2.79倍；颞叶与枕叶、海马表达量均值之间有统计学意义；顶叶与枕叶、海马表达量均值之间有统计学意义；额叶、颞叶、顶叶均值之间差异，枕叶与海马之间差异均无统计学意义。

度地利用氧，并产生尽可能多的能量；脑组织的缺氧适应能够使损坏脑细胞的不良因素得到抑制或调整，使脑组织在不良环境下度过危险期^[10]。ANT在能量代谢中发挥着重要作用，本试验通过测定SLC25A6基因在高原习服黄牛脑组织中的表达情况，间接反映脑组织不同部位在高原低氧习服情况下对能量的利用情况。

由于反转录产物cDNA为单链，而标准品质粒为双链，所以进行Real-time PCR时，先将cDNA进行1个循环的扩增，使其变为双链，后与标准品一同进行40个循环，以避免单链与双链之间的差异^[11]。试验结果表明，标准曲线的扩增效率为E=104.9%，回归系数r=-0.996，斜率为-3.210，溶解曲线峰值单一。从这些参数可以看出标准曲线线性关系良好，引物特异性较强。结果能够真实反映出SLC25A6基因在高原习服黄牛脑组织中的实际拷贝数。

本研究结果表明，在高原习服黄牛脑组织中SLC25A6基因的表达量从高到低依次为小脑、海马、枕叶、额叶、颞叶、顶叶，小脑表达量显著高于其组织，小脑SLC25A6基因表达量为额叶表达量的2.79倍。顶叶消耗能量强度较低，细胞能量代谢较弱，小脑消耗能量强度较大，细胞能量代谢较强。可以推断顶叶为低氧环境敏感区域，小脑抗低氧能力较强。

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[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

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[8]兰春慧，房殿春，樊丽琳，等. 线粒体内膜蛋白ANT在幽门螺杆菌致胃癌细胞凋亡中的表达[J]. 胃肠病学和肝病学杂志，2009，18（2）：100-102.

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