浙江省猪伪狂犬病病毒分离及其gD和gE基因遗传变异分析

谢荣辉，袁秀芳，王雅婷，安慧婷，董建斐，黄 靖，张 璐，徐 辉，赵灵燕*

(1.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 310018；2．浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是引起猪伪狂犬病的病原体，导致母猪繁殖障碍和新生仔猪急性死亡，病死率高达90%以上。目前，本病在全球范围内普遍流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。此外，也有人感染PRV而引起发病的报道[1-3]。PRV属于疱疹病毒科，基因组为约143 kb的线性双链DNA，其中gD基因编码的糖蛋白为具有重要的抗原表位，能诱导宿主机体产生中和抗体，在病毒感染和宿主免疫过程起着重要的作用[4-5]。gE基因是PRV的主要毒力基因，其编码的糖蛋白主要介导病毒的扩散和融合，该基因缺失将导致病毒毒力减弱[6-8]。gD和gE基因目前常被广泛应用于分子流行病学和变异研究[1,4-10]。

近年来，部分规模化养猪场虽然免疫了伪狂犬病减毒疫苗，但仍存在着PRV野毒感染和发病情况[1,11-16]。研究显示，Bartha-K61等传统的猪伪狂犬病减毒疫苗无法对近年来PRV变异株提供充足有效的保护，意味着目前国内PRV流行株发生了变异[9]。为了更好地掌握近年来浙江省PRV变异状况和毒株类型，为合理选择疫苗和PRV防控提供科学依据，本试验对2018-2019年从浙江省各地采集的PRV阳性组织进行了病毒分离，并进行gD和gE基因克隆、序列分析及氨基酸位点研究。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂BHK-21细胞由本实验室保存；DNA凝胶回收试剂盒、LA Taq酶、Ex Taq酶、DL2000 DNA Marker、大肠杆菌DH5α感受态细胞和X-gal均购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM®-T Easy Vector Systems购自Promega公司；病毒核酸提取试剂盒购自ABI公司；LB固体培养基、LB液体培养基、异丙基硫代半乳糖苷均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 病料采集和处理PRV阳性组织病料采自浙江省内规模化猪场。将采集的组织病料剪碎，加适量的无菌PBS缓冲液进行研磨，反复冻融3次后10 000 r/min 离心5 min,取上清备用。

1.3 病毒分离培养将处理后的样品上清液接种于BHK-21单层细胞上，37℃、CO2培养箱中吸附1.5 h，弃去接种液，再用PBS洗涤1次，加入含3%胎牛血清和1%双抗(含100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素)的DMEM维持液,置于37℃、CO2培养箱中培养。逐日观察细胞病变,当细胞病变达到80%及以上终止培养。接种6 d后若无病变，则冻融3次后再次接种BHK-21细胞，盲传3代，若无病变，则废弃。

1.4 荧光定量PCR鉴定对出现细胞病变的培养物提取核酸，参考文献[17]，利用上游引物PRV-gE-real-F(272)：5′-AGGGCGCCAACTTCACCCT-3′和下游引物PRV-gE-real-R(368)：5′-CTCGAAGCACACCGTGGTCA-3′及探针PRV-gE-Probe：5′-HEX-CGGGATCTGGACGTTCCTGCCC-BHQ1-3′对培养物进行PRV荧光定量PCR检测。反应体系如下：10×Ex Taq buffer 2 μL，Ex Taq 0.1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL,探针(10 μmol/L)0.4 μL，dNTP Mixture 2 μL，DNA模板2 μL，无RNA酶的水12.7 μL。反应条件：95℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，45个循环；72℃条件下收集荧光信号。

1.5 引物设计与合成根据GenBank中PRV毒株HN1201的核苷酸序列(GenBank登录号：KP722022)，针对gD和gE基因分别设计引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及扩增长度

1.6gD和gE基因的扩增和克隆按照病毒核酸提取试剂盒说明书提取病毒核酸。以病毒核酸为模板，分别利用引物PRV-gD-F/PRV-gD-R和PRV-gE-F/PRV-gE-R扩增分离株gD和gE基因的片段。gD基因扩增反应体系如下：10×LA Taq buffer Ⅱ 5 μL，LA Taq 0.5 μL，PRV-gD-F 1 μL，PRV-gD-R 1 μL,dNTP Mixture 8 μL，模板5 μL，无RNA酶的水29.5 μL。扩增条件：94℃预变性1 min；98℃变性 10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。gE基因扩增反应体系如下：10×LA Taq bufferⅠ 5 μL，LA Taq 0.5 μL，PRV-gE-F 1 μL，PRV-gE-R 1 μL,dNTP Mixture 8 μL，模板5 μL，无RNA酶的水29.5 μL。扩增条件：94℃预变性1 min；98℃变性 10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。对目的基因片段按试剂盒说明进行割胶回收，并克隆于pGEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上培养18～24 h。选取单菌落进行培养，利用菌落PCR方法进行重组菌株筛选，将重组菌株送生工生物(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.7 序列分析利用DNAStar软件对分离株gD和gE基因及GenBank收录的参考毒株进行核苷酸和氨基酸同源性分析。利用Mega 5.1软件构建系统进化树，进行遗传进化分析。本试验所引用的参考毒株信息见表2。

表2 本试验所引用的参考毒株信息表

2 结果

2.1 病毒分离鉴定30份组织病料接种BHK-21细胞经2次传代培养后，其中11份样品接种细胞后可见典型的PRV细胞病变，细胞变圆，肿胀和融合(图1)；用PRV荧光定量PCR方法检测，11个分离株均出现典型的S型扩增曲线(图2)，分别命名为ZJ03、ZJ07、ZJ10、ZJ11、ZJ12、ZJ13、ZJ18、ZJ20、ZJ25、ZJ29和ZJ30。

A.正常BHK-21 细胞；B.感染PRV的BHK-21 细胞

1.ZJ10；2.ZJ20；3.ZJ07；4.ZJ03；5.阳性对照；6.ZJ18；7.ZJ30；8.ZJ25；9.ZJ12；10.ZJ11；11.ZJ29；12.ZJ13；13.阴性对照

2.2 病毒gD和gE基因扩增结果11株病毒gD和gE基因扩增PCR产物分别经2%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约1 200，1 700 bp处出现1条很亮的条带，与预期的扩增结果相符合(图3，4)。

2.3gD基因同源性和进化分析11个分离株gD基因由1 209个碱基组成，编码402个氨基酸。同源性分析结果显示：11个分离株之间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.3%～99.9%和98.0%～100.0%；与2011年以前的国内流行株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%～99.7% 和98.5%～100.0%；与2011年以后国内流行毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.5%～100.0%和99.0%～100.0%；与欧美株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.4%～99.3%和96.5%～99.3%；与Bartha疫苗株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.4%～98.8%和96.5%～97.5%。

gD基因进化分析结果显示，本试验中的11个分离株与国内2011年以后流行代表株JSY7、HNX、HN1201和HLJ8处于同一个分支，亲缘关系较近，而与欧美毒株亲缘关系较远(图5)。与现行疫苗株Bartha相比，本试验中的11个病毒分离株gD基因在825～830位均存在着“CAGGCC” 6个碱基插入(对应氨基酸277～278位存在2个氨基酸插入)，gD蛋白均存在着10个氨基酸位点的突变：69位A→V、82位S→N、207位N→S、209位E→D、212位R→K、284位V→A、305位H→R、338位Q→P、342位P→T和391位T→A。此外个别分离株还存在其他氨基酸的突变。与国内经典株Ea相比,本试验中的11个病毒分离株gD基因在832～837缺失了“AGGCCC”6个碱基(对应氨基酸279～280位PR缺失)(图6)。

1.ZJ03；2.ZJ07；3.ZJ10；4.ZJ11；5.ZJ12；6.ZJ13；7.ZJ18；8.ZJ20；9.ZJ25；10.ZJ29；11.ZJ30；M.DL2000 DNA Marker

1.ZJ03；2.ZJ07；3.ZJ10；4.ZJ11；5.ZJ12；6.ZJ13；7.ZJ18；8.ZJ20；9.ZJ25；10.ZJ29；11.ZJ30；M.DL2000 DNA Marker

2.4gE基因同源性和进化分析分离株ZJ10gE基因由1 743个碱基组成，编码580个氨基酸；分离株ZJ07gE基因由1 737个碱基组成，编码578个氨基酸；其他9个分离株gE基因均由1 740个碱基组成，编码579个氨基酸。同源性分析结果显示，本试验中的11个病毒分离株之间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.5%～99.9%和99.0%～99.8%；与我国2011年以前的国内流行株核苷酸和氨基酸的同源性分别为 99.0%～99.7%和98.3%～99.8%；与我国2011年以后国内流行毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%～100.0%和99.1%～100.0%；与欧美毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.6%～98.1%和93.9%～96.2%。

图5 gD基因核苷酸进化树分析

图6 PRV gD蛋白氨基酸序列分析

与Becker等欧美毒株gE蛋白氨基酸序列相比，本试验中的11个分离株氨基酸序列均在48位增加了1个天冬氨酸(D)；除了ZJ07以外其余10个分离株氨基酸序列均在495位插入1个天冬氨酸,与国内2011年以后不同地区分离的PRV毒株在这个位点的高度变异一致。ZJ10株在399位插入了1个甘氨酸。与Becker、Kaplan等欧美毒株相比，所有分离株的gE蛋白存在着23 个氨基酸位点的突变：53位G→D、58位D→N、2位N→D、105位V→L、121位A→S、148位R→M、162位Q→R、178位T→S、180位R→L、214和215位由LA→AD、447位V→I、470位G→R、472位R→H、499和500位由DA→VI、505位S→A、518位V→A、522位V→A、522位A→P、569位S→N、573和574位NA→MS。此外，个别分离株还存在氨基酸突变(图7)。

图7 PRV gE蛋白氨基酸序列分析

gE基因进化分析结果显示，本试验中的11个病毒分离株与国内2011年以后流行代表株JSY7、HNX、HN1201和HLJ8处于同一个分支，亲缘关系较近，而与欧美毒株亲缘关系较远(图8)。

图8 gE基因核苷酸进化树分析

3 讨论

当前，虽然Bartha-K61等猪伪狂犬病疫苗已广泛使用，并有效地控制的PRV的暴发和流行，但仍有疫苗免疫猪场发生猪伪狂犬病并且分离到PRV野毒[12-16]。研究显示，2011年以来PRV分离毒株与传统毒株相比发生了明显的变异[18-23]，传统的Barhta-K61疫苗对国内20世纪80年代流行毒株SC攻击的猪可以提供100%的保护，但对近年流行的PRV HeN1等变异株的攻击仅能提供较低的保护[24-26]。血清学调查结果显示，我国猪群中PRV野毒感染率高且感染范围广。宁慧波等[27]于2016-2018年对我国24个省(市、自冶区)的1 461个猪场进行PRV野毒感染检测，结果显示猪场的场点阳性率分别为80.93%，81.92%和75.75%，样品阳性率分别为36.03%，34.52%和32.45%。赵灵燕等[28]于2016-2018年对浙江省26个猪场(其中25个猪场免疫PRV疫苗)监测发现猪群中PRV野毒感染率达37.4%，其中PRV抗体样品阳性率在50.0%以上的规模化猪场数量达8个以上。因此，对浙江省PRV的流行毒株开展遗传变异分析，及时掌握PRV的流行株的变异情况，对浙江省猪伪狂犬病防控措施的制定具有重要意义。

本试验从30份PRV阳性样品中成功分离了11株PRV，对11株分离病毒的gD和gE基因进行同源性和遗传分析发现，11株分离病毒与国内2011年以后流行的PRV参考毒株核苷酸和氨基酸序列同源性较高，而与Bartha等欧美毒株的同源性较低。系统进化树分析显示：本试验的11株分离病毒、JS-2012等2011年以后国内PRV参考毒株与Ea等2011以前的国内经典毒株可归为一个大的分支，为基因Ⅱ型。而欧美毒株则属另一大分支，为基因Ⅰ型[29]。

gD基因编码的糖蛋白是PRV主要的保护性抗原，能诱导宿主产生中和抗体，在病毒粒子侵袭宿主细胞中发挥着重要的作用。与现行疫苗株Bartha相比，本试验的11个分离株gD基因在825～830位插入“CAGGCC”6个碱基(对应氨基酸序列277～278位插入了2个氨基酸)，gD蛋白均存在着10个氨基酸差异，这些位点氨基酸的改变能否引起病毒抗原性及免疫原性发生变化，造成传统疫苗的免疫失败则有待于进一步研究。研究显示，gE基因是PRV的主要毒力基因，其基因序列的改变可能会对病毒毒力及抗体的有效中和产生一定影响。与Becker等欧美毒株和国内的经典株相比，除了ZJ07株以外，其余10株分离病毒均在氨基酸序列48位和495位各有1个天冬氨酸的插入，而这一特点可作为鉴定PRV变异株的分子特征[30]。与Becker等欧美毒株相比，所有分离毒株的gE蛋白存在着23个氨基酸位点的突变；与Ea等国内经典株相比，11株分离病毒在第54，404，519位点均存在差异，这些变异可能也与PRV毒力变化有关。