反相高效液相色谱—串联质谱法测定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量

张婷婷等

摘要：建立了反相高效液相色谱串联质谱法测定母乳和婴幼儿奶粉中5种核苷和5种核苷酸含量的方法。样品经温水溶解后，选择0.5 %乙酸沉淀蛋白，并用超滤离心管离心过滤大分子物质；采用键合较长碳链的Acclaim C30色谱柱为分析柱，以20 mmol/L醋酸铵和乙腈为流动相，梯度洗脱分离，流速0.4 mL/min，温度15 ℃，紫外检测波长260 nm，采用电喷雾正离子模式进行电离，选择反应监测模式进行检测，外标法定量分析。结果表明，核苷和核苷酸在12 min内达到基线分离，在0.02～100 mg/L范围内，线性关系好，相关系数R>0.999，方法检出限0.1～0.2 ng，其中CMP， UMP， GMP， U， AMP在1， 10和50 mg/L加标水平下的平均回收率在85.2%～104.7%之间，峰面积RSD在0.7 %～2.0%之间（n=6），核苷C， I ， G ， A和核苷酸IMP在0.5， 5和10 mg/L加标水平下的平均回收率在85.08%～103.7%之间，峰面积RSD在0.6%～1.7%之间（n=6）。应用本方法定性和定量分析母乳和婴幼儿奶粉中核苷和核苷酸的含量，并且对紫外和质谱测定的结果进行比较，基本一致。

关键词：液相色谱；质谱；核苷；核苷酸；母乳；奶粉

1引言

核苷是由碱基加上环状核糖或脱氧核糖组成，包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷等（图1）。核苷与磷酸以酯键连成核苷酸，成为核酸的组成单位。研究表明，摄入适量的核苷和核苷酸能够有效降低腹泻的风险、保持体内微生物环境的平衡、提高免疫功能和调控脂质代谢等[1～4]。母乳中含有多种核苷和核苷酸，而牛奶中一般不含有核苷和核苷酸，因此许多奶制品公司将核苷酸作为重要的添加剂。临床研究显示，婴幼儿奶粉中添加适量的核苷酸，有助于较小婴儿肠胃的生长发育[5]。目前，婴幼儿奶粉中5种核苷酸（AMP， GMP， UMP， CMP和IMP）的含量有国际标准，欧盟规定婴儿食品中核苷酸的总含量不超过5 mg/100 kcal，而美国规定的含量上限为16 mg/100 kcal[6，7]。研究者希望深入研究母乳中各种核苷和核苷酸的含量，以此为基础，生产出各项指标更加接近母乳的婴幼儿奶粉，促进婴幼儿更健康地生长。

目前，测定核苷酸的方法包括荧光法[8]、毛细管电泳法[9，10]、离子交换色谱法[11]、反相高效液相色谱法（RPHPLC）[12]、液相色谱质谱法[13～15]等。比色法易受干扰，操作比较复杂；毛细管电泳测定结果的重现性不好；离子色谱分离核苷酸结果较好，受基质干扰较少，但是流动相与质谱不兼容；液相色谱方法操作简单，分析速度快，重现性较好，但是核苷酸极性较强，在常规反相色谱柱上保留较弱，而婴幼儿奶粉基质又比较复杂，容易受到基质干扰[16]。

本研究采用Acclaim C30色谱柱，其具有比C18填料更长的疏水性碳链，对各种核苷和核苷酸具有更高的分辨率，同时增加了疏水性较弱的胞嘧啶核苷酸与色谱固定相的作用力，避免复杂基质的干扰。以此为基础，建立了反相高效液相色谱串联质谱法测定5种核苷和5种核苷酸（结构式见图1）的分析方法，并应用于母乳和婴幼儿奶粉的含量测定中。本方法快速，灵敏度高，适合于复杂基质样品的分析。

3.5样品测定

按照2.4节样品前处理和2.2节色谱条件进行测定，外标法定量分析。分别采用紫外和质谱定量分析某品牌奶粉和母乳中核苷和核苷酸的含量，结果见表6，两种方法的测定结果一致。结果表明，本方法快速、灵敏度高，可用于对母乳和婴幼儿奶粉中核苷和核苷酸含量的测定，确保核苷和核苷酸在婴幼儿奶粉中的添加量在合理范围内，接近或达到母乳的功效。

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