氢溴酸槟榔碱通过中枢神经迷走胆碱能系统促进犬胃肠运动

陈其城，蒋 志，张骏鸿，叶 飞，曹立幸

槟榔碱是中药槟榔的主要活性成分[1]，其氢溴酸化合物是槟榔碱的稳定结构。既往的研究表明，槟榔碱为M3受体激动剂，可促进胃肠道收缩[2]。胃肠运动不仅受肠神经系统（ENS）调节，也受中枢神经系统（CNS）的调控。侧脑室是CNS最大的脑室，通过脑脊液与脑干神经核团，特别是迷走神经复合体，包括迷走运动背核（DMV）和孤束核（NTS）有紧密的联系[3]。经侧脑室微量注射可以了解药物是否通过CNS发挥对胃肠运动的作用，Kinzig等[4]使用侧脑室、第四脑室、DMV等注射胃促生长激素的方式，证实了胃促生长激素通过CNS调控胃肠运动作用。而槟榔碱是否能通过CNS调控胃肠道运动仍不清楚。本课题组前期已经明确氢溴酸槟榔碱有促胃肠动力作用[5-6]，并利用应力传感器建立了犬胃肠移行性复合运动（MMC）的记录方法[7]，本研究观察氢溴酸槟榔碱侧脑室给药对犬胃肠动力的作用及其中枢调控胃肠运动的下行通路。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性12月龄健康比格犬6只，体质量（14.0±1.0）kg，购自广州医药研究总院有限公司实验动物研究开发中心。本实验方案通过广东省中医院动物实验伦理委员会批准（批准号：2018003）。

1.2 实验试剂 氢溴酸槟榔碱（中国阿拉丁公司），阿托品（美国sigma公司），丙泊酚注射液(四川国瑞药业有限责任公司)。

1.3 主要仪器 应力传感器（美国Micromeasurements公 司， 型号：J2A-06-S110K-10C）导线连接电桥，并用Porti多通道动态和静态测量系统(荷兰TMSI公司)记录胃肠运动信号。不锈钢胃瘘造管（内孔径2 cm×高4 cm×底盘直径3.5 cm）。

1.4 犬胃肠运动观察 术前2周训练动物，使之适应实验环境。术前禁食12 h，先用丙泊酚5 mg/kg基础麻醉，随后静脉灌流10～20 mg/(kg·h)维持麻醉。在无菌条件，气管插管全麻下完成下列手术: 1)腹部安装胃瘘管：在贲门下4 cm胃体处安装一个不锈钢胃瘘管用于实验时灌入药物，以避免动物拒绝口服药物。2)应力传感器植入：用5个高灵敏度应力传感器分别缝在胃体（胃窦上2 cm）、胃窦(距幽门上2 cm)、近端十二指肠(距幽门下5 cm)、近端空肠(距Treitz韧带1 cm)及远端结肠(降结肠中部)以记录胃肠机械收缩活动。应力传感器导线由不锈钢套管引出体外。3）颈外静脉插管，使用内径0.1 mm外径0.15 mm硅胶管，10 U肝素钠盐水封管。4）侧脑室、第Ⅳ脑室置管：应用脑立体定位仪，于额顶缝、人字缝交点，旁开0.5 cm，使用颅钻各钻1孔，放入金属置管（内径0.2 mm），置管深度1.5 cm，做侧脑室置管，然后使用牙托粉固定。

1.5 干预方法 1）所有动物先观察120 min，以记录各组动物MMC参数。并在植入传感器手术当天麻醉状态及术后1 d后清醒状态下，在MMC曲线处于Ⅰ相时，从低剂量至高剂量依次给予侧脑室注射氢溴酸槟榔碱（1.25、2.5和5 μg，每次20 μL），每个剂量间隔至少2 h，每只动物重复2次。2）为了明确氢溴酸槟榔碱的作用是通过胆碱能神经起作用，应用胆碱能受体拮抗剂阿托品进行阻断实验：完成上述观察后，各组动物先记录胃肠运动120 min，随后在静脉灌流阿托品50 μg/( kg·h)的情况下，按分组给予侧脑室药物注射后再记录60 min。3）为了明确氢溴酸槟榔碱的下行通路，进行双侧颈迷走神经切断术：完成上述实验后，待动物恢复1周后进行双侧颈迷走神经切断术，于丙泊酚维持麻醉，气管插管无菌条件下，动物取仰卧位，从左右颈总动脉仔细分离迷走神经，使用1#丝线结扎近端和远端，分别剪去0.5 cm颈迷走神经。按1）所述方案重复观察。

1.6 观察指标 实验时将应力传感器与多通道动态和静态测量系统相连，记录胃肠运动，包括：1）MMC参数：MMC总时程及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ相时程。2）药物的作用：计算给药前后20 min的胃肠运动参数：（1）收缩波频率：收缩波频率=收缩波次数/时间；（2）平均振幅：振幅之和/收缩波次数；（3）动力指数：单位时间收缩波振幅总和，即频率×平均振幅。

1.7 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，各组实验数据以均数±标准差表示，各组给药前后比较均采用配对t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氢溴酸槟榔碱对犬胃肠运动的影响 应力传感器植入术后丙泊酚维持麻醉的情况下，犬胃体、胃窦、十二指肠、空肠和结肠收缩运动显著抑制，周期性MMC运动消失，只存在无收缩运动的Ⅰ相样静息期；给予侧脑室注射氢溴酸槟榔碱1.25、2.5和5 μg后，均可增强犬胃体、胃窦、十二指肠、空肠和结肠收缩运动，Ⅰ相静息期运动模式立即转变为Ⅲ相样高振幅高频率收缩模式，收缩持续5～10 min（图1）。分别与给药前和生理盐水比较，除外1.25 μg的剂量，2.5 μg和5 μg的氢溴酸槟榔碱侧脑室注射后，胃肠收缩动力指数增加，差异有统计学意义（均P＜0.001，图2）。

图1 麻醉状态下犬侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对胃肠运动曲线的影响

图2 麻醉状态下犬侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对胃肠动力指数的影响

在MMC Ⅰ相时给予侧脑室注射氢溴酸槟榔碱1.25、2.5和5 μg，与麻醉状态相比较，清醒状态下给予氢溴酸槟榔碱不同剂量均可产生更强烈、更持久的收缩（图3），与给药前比较，较低剂量（1.25 μg）氢溴酸槟榔碱即可显著增强胃体、胃窦、十二指肠和空肠收缩动力指数（均P＜0.05，图4）。与麻醉状态比较，清醒状态下给予1.25 μg氢溴酸槟榔碱可使胃肠动力指数增加66.94%～132.06%。

图3 清醒空腹状态下犬侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对胃肠运动曲线的影响

图4 清醒空腹状态下犬侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对胃肠动力指数的影响

2.2 阿托品完全阻断侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对犬胃肠运动的增强作用 经静脉一次性注射阿托品50 μg/kg，并持续灌流阿托品50 μg/(kg·h)以维持胃肠运动抑制效果（图5）。灌流阿托品10 min后，侧脑室注射氢溴酸槟榔碱1.25、2.5和5 μg均不能增强胃肠收缩运动。

图5 阿托品完全阻断侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对犬胃肠运动的增强作用

2.3 双侧颈迷走神经切断术后犬胃肠运动情况 典型的空腹状态下清醒犬MMC如图6所示，MMC主要由Ⅰ相静息期，Ⅱ相间断收缩期，Ⅲ相高振幅高频率收缩期和IV相恢复期组成。胃窦Ⅲ相收缩波可向下传播，使十二指肠、空肠甚至结肠产生移行性运动。切断犬颈双侧迷走神经并不能废除胃肠MMC运动，MMC静息和运动交替现象依旧存在（图7）。迷走神经切断术后，犬MMC运动周期明显延长，尤其是Ⅰ相持续时间显著延长（表1），胃体和胃窦Ⅲ相收缩持续时间减少，平均收缩振幅分别由（26.74±3.37）g和（22.33±2.60）g下降至（17.42±2.18）g和（15.20±1.44）g；而十二指肠、空肠则Ⅲ相收缩与正常对照比较差异不显著，结肠簇状收缩间隔时间明显延长（表1）。

表1 双侧颈迷走神经切断术后犬胃肠MMC运动周期

图6 清醒犬空腹状态下犬胃肠MMC曲线图

图7 双侧颈迷走神经切断术后犬胃肠MMC曲线图

2.4 侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对双侧颈迷走神经切断术后犬胃肠运动的影响 切断双侧颈迷走神经后给予侧脑室注射氢溴酸槟榔碱1.25、2.5和5 μg后，均未能使胃体至结肠产生明显收缩增强（均P＞0.05，图8）。

图8 侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对双侧颈迷走神经切断术后犬胃肠运动的影响

3 讨论

槟榔碱是中药槟榔主要的药理活性成分，含量在0.1%～0.5%之间[1]，槟榔的生物碱难溶于水，槟榔碱在碱性条件下易分解为槟榔次碱和去甲槟榔碱，遇酸可以形成类似于盐的物质[8]，通常以结合盐的形式存在，氢溴酸槟榔碱为其稳定的化合物。《中国药典2020年版》规定，以氢溴酸槟榔碱作为对照品，检测得槟榔中槟榔碱含量不得少于0.2%。因此，大多数研究也利用氢溴酸槟榔碱研究槟榔碱的含量及药理学活性[9-10]。

槟榔碱是我院制剂五达颗粒的主要活性成分之一，质量分数为（445.27±12.39）μg/g[11]，可能是其产生促胃肠动力作用的主要物质。通过胃肠肌条离体实验已经证实，氢溴酸槟榔碱可以通过M3受体增强小鼠[2]和大鼠[5]胃肠肌条收缩运动。利用ICC细胞缺乏的W突变小鼠证明，氢溴酸槟榔碱促进小鼠小肠收缩的作用也与抑制电压门控钾离子通道，使平滑肌慢波去极化有关[6]。这些对槟榔碱的研究大多都是在组织及细胞水平完成的，使用应力传感器植入的方式实时记录在体动物胃肠机械运动能更好的反映药物的效果[7,12]。本课题组前期研究用应力传感器实时记录了比格犬[7]和小鼠[12]的胃肠机械运动，本研究记录麻醉及清醒状态犬胃肠运动的情况，其中清醒犬的MMC数据可与经典文献相互印证[13]。

本研究发现侧脑室给予氢溴酸槟榔碱可以显著增加胃体、胃窦、十二指肠、空肠和结肠收缩运动，表明氢溴酸槟榔碱具有中枢促胃肠动力作用。该效应可被阿托品完全阻断，这提示槟榔碱主要是通过迷走神经胆碱能通路起作用的。神经追踪技术表明，为胃肠道提供副交感神经支配的迷走神经运动神经元起源于DMV[14]。而DMV神经元的活动，以及迷走神经的传出活动，也受到来自脑干和中枢神经系统高级核团的突触输入的调节[15]。在麻醉条件下，DMV神经元由持续的抑制性氨基丁酸(GABA)能输入调节，这些抑制性输入主要来自于邻近的NTS[16]。丙泊酚可以激活GABA受体，产生中枢神经系统抑制[17]，抑制性的GABA能神经通过DMV支配胃肠运动[18]，并使周期性的移行性复合运动消失。而在丙泊酚维持麻醉的情况下，给予侧脑室注射槟榔碱依然可以产生显著的胃肠运动增强作用，这表明GABA能神经不参与槟榔碱的中枢效应。

位于侧脑室的迷走神经复合体含有DMV和NTS两个核团，是迷走神经传入和传出中枢的通路[19]，若将迷走神经切断，则这一通路即被阻断，中枢对胃肠运动的调控能力也被削弱。本实验也证实，切断双侧颈迷走神经后，犬胃肠MMC周期延长，MMC II/Ⅲ相收缩期振幅、频率和动力指数明显下降，提示中枢迷走-迷走反射可能参与胃肠MMC的调节。而且通过手术切断颈双侧迷走神经阻断其下传通路[20]后，侧脑室注射氢溴酸槟榔碱对胃肠运动的增强作用也被完全阻断，表明槟榔碱的作用是通过中枢迷走神经复合体及其迷走-迷走反射通路实现的。

综上，槟榔碱侧脑室给药可以剂量依赖性地增强胃体至结肠的收缩运动，该效应可能是通过迷走胆碱能神经下行通路而实现的，但是CNS的许多核团（如孤束核、下丘脑、迷走神经背核、延髓极后区等）[3]以及脊髓交感神经[21]也能通过下行通路调节胃肠运动。而槟榔碱是通过中枢哪一核团支配胃肠道动力，是否通过脊髓交感神经通路，这仍需要后续进一步的实验研究。