当归红芪超滤物对X射线引起人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制

武兵兵,张爱平,赵信科,李应东,刘 凯,

（1.甘肃中医药大学中西医结合学院 中西医结合临床重点实验中心，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院心血管内科，甘肃 兰州 730000）

放射治疗（简称放疗），是通过辐射所产生的能量使细胞染色体损伤，致细胞停止生长，达到快速消灭癌细胞的一种治疗疾病方式。尽管放疗对于治疗肿瘤效果显著，但对周围正常组织造成的辐射损伤不容忽视，尤其是胸腔纵膈肿瘤放疗后常导致放射性心血管损伤。研究［1-2］表明：心血管内皮细胞对放疗辐射的敏感性高于心肌细胞，长期放疗的辐射对心血管内皮细胞的损伤可诱发其功能障碍，从而促进多种心血管疾病发生。目前其确切的发病机制尚未阐明，而相关中医药防治机理研究尤为薄弱。中医学研究［3］显示：辐射为外来“毒邪”范畴，气虚血瘀为其致病的基本病机。当归和红芪是我国传统的益气活血类中药，本课题组前期研究［4-5］表明：复方制剂当归红芪超滤物（ultrafiltration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix，UFE-AH）对X射线辐射损伤心肌细胞有较强的防护作用，但其对X射线辐射导致心血管内皮细胞损伤作用及其机制的研究尚未见报道。因此，本研究建立X射线辐射人脐静脉内皮细胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）损伤模型，探讨UFE-AH对辐射损伤HUVECs的保护作用及机制，为甘肃道地药材的开发和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器HUVECs（上海富衡细胞库）。UFE-AH由甘肃中医药大学科研实验中心和甘肃省膜科学研究院联合制备。内皮细胞培养基（美国ScienCell公司），细胞凋亡检测试剂盒（上海翊圣公司），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体、磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinosital-3 kinase，PI3K）抗体、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗体、磷酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗 体 和 兔抗人GAPDH抗体（美国Gene Tex公司），兔抗人B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体和兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋 白 水 解 酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）抗体（杭州华安生物技术有限公司），HRP标记的山羊抗兔IgG（美国Immuno Way公司）。酶标仪和凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（型号：FACSVerse）（美国BD公司），细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司），投射电子显微镜（型号：HT7700）（日本HITACHI公司），X射线辐照仪（美国Faxitron公司）。

1.2 细胞培养常规复苏HUVECs，将其接种于25 cm2培养瓶中，采用含5%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青-链霉素的内皮细胞培养基，37℃、5% CO2条件下在细胞培养箱中培养，细胞生长融合至80%～90%时，进行传代。

1.3 CCK-8法检测X射线辐射后HUVECs的抑制率取对数生长期的HUVECs，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，每组设6个复孔，培养24 h后给予0、2、4、6、8和10 Gy不同剂量X射线辐射，于培养箱内分别培养24、48和72 h后 向 每 孔 加 入10 μ L CCK-8试 剂，37℃孵育2 h。采用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞抑制率。细胞抑制率=（未辐射孔A值-辐射孔A值）/（未辐射孔A值-空白孔A值）。

1.4 CCK-8法检测不同浓度UFE-AH作用后HUVECs的存活率取对数生长期HUVECs，以每孔2.5×103个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，分别加入0、50、100、200、400、600、800和1 000 μg·L－1UFE-AH，每个浓度组设置6个复孔，置于细胞培养箱中分别培养24、48和72 h。采用酶标仪于450 nm波长处测定A值，计算细胞存活率，确定本实验UFE-AH的最佳干预剂量。细胞存活率=（加药孔A值－空白孔A值）/（未加药孔A值－空白孔A值）。

1.5 CCK-8法检测各组细胞存活率实验分为空白组、模型组（6 Gy X射线）、低剂量UFE-AH组（6 Gy X射 线+100 μg·L－1UFE-AH）、中 剂 量UFE-AH组（6 Gy X射线+200 μg·L－1UFE-AH）和 高剂量UFE-AH组（6 Gy X射线+400 μg·L－1UFE-AH）。以每孔5×103个细胞接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，空白组和模型组正常换液处理，药物干预组分别给予100、200和400 μg·L－1UFE-AH干预24 h，除空白组外其余各组均给予6 Gy X射线辐射，继续培养48 h后采用CCK-8法检测各组细胞A值，计算细胞存活率，每组设6个复孔。细胞存活率=（加药孔A值－空白孔A值）/（未加药孔A值－空白孔A值）。

1.6 流式细胞术检测各组细胞凋亡率各组HUVECs干预后采用无EDTA胰酶消化，收集各组细胞及上清液，1 000 r·min－1离心5 min；采用1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞密度约为1×106mL－1，各 组 加 入AnnexinV-FITC（5 μ L）和PI（5 μL），避光孵育15 min后上机，1 h内采用流式细胞仪分析。细胞凋亡率=（早期细胞凋亡数+晚期细胞凋亡数）/细胞总数×100%。

1.7 透射电子显微镜下观察各组细胞超微结构收集各组HUVECs，戊二醛4℃避光固定，过夜，锇酸固定，再经梯度乙醇及丙酮脱水，浸透，包埋，切片，采用铀铅双染色，透射电子显微镜下观察并拍照。

1.8 Western blotting法检测各组细胞中PI3K、Akt、p-Akt、VEGF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平取各组HUVECs，预冷PBS缓冲液洗涤2次，加入组织细胞裂解液，12 000 r·min－1离心15 min，吸取上清液，取少量上清采用BCA法测定蛋白浓度，等量上样，SDS-PAGE电泳、PVDF转膜和5%脱脂奶粉封闭后，TBST洗膜3次，每 次8 min。然 后 一 抗4℃孵 育 过 夜（GAPDH 1∶5 000稀 释，PI3K、Bcl-2、Bax和caspase-3 1∶1 000稀释，Akt、p-Akt和VEGF 1∶500稀释），TBST洗膜3次，每次8 min。二抗室温摇床孵育2 h、TBST洗膜3次，每次10 min。采用ECL化学发光法和凝胶成像仪进行曝光，以GAPDH为内参，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.9 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0.2统计软件进行统计学分析。各组细胞抑制率，细胞存活率，细胞凋亡率，细胞中PI3K、Akt、p-Akt、VEGF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平均符合正态分布，以-±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 X射线辐射后各组细胞抑制率采用0、2、4、6、8和10 Gy X射线辐射HUVECs后，CCK-8法检测结果显示：在辐射后24 h，各组HUVECs的细胞抑制率为负值；辐射后48和72 h，当辐射剂量大于2 Gy时，与0 Gy X射线组比较，各组HUVECs的细胞抑制率呈剂量依赖性增加，其中4、6、8和10 Gy均可抑制细胞生长（P＜0.05或P＜0.01），6、8和10 Gy抑制细胞生长作用更明显（P＜0.01）。因此，可选择6 Gy作为辐射造模剂量。见表1。

表1 CCK-8法检测X射线辐射后各组HUVECs的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of HUVECs after irradiated with X-ray detected by CCK-8 assay (n=6，-±s，η/%）

表1 CCK-8法检测X射线辐射后各组HUVECs的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of HUVECs after irradiated with X-ray detected by CCK-8 assay (n=6，-±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with 0 Gy X-ray group.

Group 0 Gy X-ray 2 Gy X-ray 4 Gy X-ray 6 Gy X-ray 8 Gy X-ray 10 Gy X-ray Inhibitory rate（t/h)24 0－7.64±6.60－15.23±4.49－11.05±5.55－8.06±4.31－16.73±6.97 48 0 9.20±3.69 13.42±3.85*21.40±3.78**23.17±2.76**28.76±2.93**72 0 17.43±7.33 30.52±3.40**35.64±3.59**35.27±5.79**46.72±8.47**

2.2 UFE-AH促进细胞增殖最佳干预剂量不同浓度UFE-AH干预HUVECs 24、48和72 h后，与0 μg·L－1UFE-AH组 比 较，100、200、400和600 μg·L－1UFE-AH组细胞存活率升高（P＜0.05或P＜0.01），100、200和400 μg·L－1UFE-AH组细胞存活率明显升高（P＜0.01）。因此，本研究选 择100、200和400 μg·L－1UFE-AH为 最 佳 干 预浓度，并在X射线辐射前干预24 h，辐射后干预48 h。见表2。

表2 不同浓度UFE-AH作用后各组细胞存活率Tab.2 Survival rates of cells in various groups after treated with different concentrations of UFE-AH(n=6，-±s，η/%）

表2 不同浓度UFE-AH作用后各组细胞存活率Tab.2 Survival rates of cells in various groups after treated with different concentrations of UFE-AH(n=6，-±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with 0 μg·L－1 UFE-AH group.

Group 0 μg·L－1 UFE-AH 50 μg·L－1 UFE-AH 100 μg·L－1 UFE-AH 200 μg·L－1UFE-AH 400 μg·L－1 UFE-AH 600 μg·L－1 UFE-AH 800 μg·L－1 UFE-AH 1 000 μg·L－1 UFE-AH Survival rate(t/h)24 100.00±0.00 111.91±15.79 131.00±16.90**164.20±16.38**145.59±15.65**128.77±10.54*124.41±12.27*112.64±10.30 48 100.00±0.00 104.87±8.81 131.71±5.84**146.14±7.80**132.12±9.19**124.60±6.78*117.84±6.34 103.35±5.71 72 100.00±0.00 119.94±4.74 146.81±5.94**152.69±3.68**129.86±3.08**123.88±5.06*112.15±3.86 80.63±3.57

2.3 各组细胞存活率CCK-8法检测结果显示：与空白组比较，模型组细胞存活率明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，中和高剂量UFE-AH组细胞存活率明显升高（P＜0.01）。见图1。

图1 CCK-8法检测各组细胞存活率Fig.1 Survival rates of cells in various groups detected by CCK-8 assay

2.4 各组细胞凋亡率AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示：与空白组比较，模型组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，低、中和高剂量UFE-AH组细胞凋亡率均明显降低（P＜0.01）。见图2。

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.5 各组细胞超微结构空白组细胞呈长梭形，细胞膜完整，胞质较均匀，细胞核呈长圆形，核膜清晰，核周隙未见增宽，线粒体呈卵圆形，未见明显肿胀，基质较均匀，嵴略模糊，少量变短，胞内可见少量溶酶体。与空白组比较，模型组细胞重度肿胀，细胞膜多处破损，胞质稀松且出现多个空泡区，细胞核呈轻度不规则形，线粒体数量明显减少，呈轻度或中度肿胀，基质变浅且不均，线粒体少部分嵴局部断裂、变短，胞内可见大量自噬溶酶体（autolysosomes，ASS）。与模型组比较，低剂量UFE-AH组细胞中度肿胀，胞内可见较多细胞器空泡，线粒体数量减少，部分出现轻度肿胀，嵴模糊，胞内可见一定量ASS；中剂量UFE-AH组细胞轻微肿胀，线粒体数量较多，无明显肿胀，基质均匀，嵴排列较整齐，胞内可见一定量ASS；高剂量UFE-AH组细胞轻微肿胀，胞内局部可见细胞器空泡，线粒体轻微肿胀，基质密度较均匀，嵴结构清晰，少量断裂，胞内可见一定量ASS。见图3。

图3 各组HUVECs超微结构(×7 000)Fig.3 Ultrastructures of HUVECs in various groups（×7 000）

2.6 各组细胞中PI3K、Akt、p-Akt、VEGF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平与空白组比较，模型组细胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2和VEGF蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低（P＜0.01），Bax和caspase-3蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，中和高剂量UFE-AH组细胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2和VEGF蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），Bax和caspase-3蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值明显降低（P＜0.01）。见图4～7。

图4 各组细胞中凋亡相关蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of apoptosisrelated proteins in cells in various groups

3 讨 论

血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，在维持血管完整性、调节血管张力和血管通透性等方面具有重要作用。辐射引起的血管内皮细胞损伤是引发心血管疾病的病理基础，其可诱导血管内皮细胞炎症、氧化应激、DNA损伤和自噬等发生，致使血管内皮细胞启动细胞凋亡途径，诱发辐射性心血管疾病［6］。近年来，中医药在防护辐射损伤方面具有突出优势，本课题组前期制备的UFE-AH由红芪和当归通过超滤截留获取，其组方来源于益气补血名方当归补血汤，采用红芪取代黄芪而成。红芪是甘肃道地药材，与黄芪功效相似，具有补气生津和利水消肿作用，当归补血活血，二药合用，共凑益气生津、补血活血和利水消肿功效［7-8］。电离辐射引起的细胞凋亡是辐射引起细胞毒性的机制之一。有研究［9-10］表明：当归多糖具有促进心肌细胞增殖和抑制细胞凋亡作用，当归红芪多糖通过抑制心肌细胞凋亡，防治辐射性心肌损伤。研究［11］显示：黄芪多糖通过下调相关因子水平，对12C6+辐射人骨髓间充质干细胞具有促增殖作用，黄芪甲苷通过减少辐射所致肺组织细胞凋亡，对辐射肺损伤起到一定的保护作用［12］。当前认为当归红芪及其活性成分具有抗辐射损伤作用，但关于UFE-AH防治辐射后血管内皮细胞损伤目前尚未见相关报道。因此，本研究旨在探讨UFE-AH对辐射后HUVECs防护作用并阐明其相关机制。

图5 各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平Fig.5 Expression levels of apoptosis-related proteins in cells in various groups

图6 各组细胞中PI3K、Akt、p-Akt和VEGF蛋白表达电泳图Fig.6 Electrophoregram of expressions of PI3K,Akt,p-Akt and VEGF proteins in cells in various groups

PI3K/Akt信号通路对细胞存活和增殖等方面至关重要，PI3K激活后，引起下游蛋白Akt活化为p-Akt，p-Akt可促进细胞生长和抑制细胞凋亡［13］。Bcl-2蛋白家族中相关蛋白在细胞凋亡的调控中起重要作用，其中Bcl-2是最重要的抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，caspase-3是Bcl-2家族通过线粒体途径调控细胞凋亡的下游促凋亡蛋白［14-15］。在线粒体凋亡调控通路中，Bcl-2与Bax形成异源二聚体抑制Bax基因的表达，从而抑制细胞凋亡，当Bax形成Bax-Bax同源二聚体时会促进 细 胞 凋 亡［16］。X射 线 辐 射 通 过 上 调Bax和caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2的表达诱导细胞凋亡［17-18］。当Akt磷酸化激活时，线粒体途径的Bcl-2接着也被激活，进而启动抗凋亡作用。研究［19］表明：UFE-AH通过上调Bcl-2蛋白表达和下调caspase-3蛋白表达对X射线引起的H9C2心肌细胞凋亡具有保护作用。本研究结果显示：X射线辐射后中和高 剂量UFE-AH组HUVECs中PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax和caspase-3蛋白表达水平降低，细胞凋亡率降低，促进HUVECs增殖。因此，UFE-AH对X射线引起的HUVECs细胞凋亡具有一定的改善作用。

图7 各组细胞中PI3K、Akt、p-Akt和VEGF蛋白表达水平Fig.7 Expression levels of PI3K,Akt,p-Akt and VEGF proteins in cells in various groups

VEGF是一种糖基化有丝分裂原，特异性影响血管内皮细胞，促进血管内皮细胞生长、迁移和抑制其凋亡，介导血管通透性增加和诱导血管生成［20-21］。血管内皮细胞通过自分泌产生的VEGF对其生存和血管内稳态至关重要，并可抑制辐射诱导的细胞凋亡［22-23］。而PI3K和p-Akt蛋白激活可诱导VEGF表达［24-25］。本研究结果显示：中和高剂量UFE-AH能 上 调VEGF蛋 白 表 达 水 平，提 示UFE-AH可能通过上调PI3K和p-Akt蛋白表达水平，诱导血管内皮细胞自分泌VEGF进而促进HUVECs存活。

线粒体能够产生能量，维持细胞正常功能，也能参与细胞凋亡和坏死［26］。血管内皮细胞中的线粒体数量有限，且其数量或形态的改变都会影响线粒体功能。SCHILLING等［27］研究发现：细胞或组织暴露于高剂量X射线辐射后可导致线粒体功能障碍和线粒体数量减少。研究［28］表明：X射线可引起冠状动脉血管内皮细胞线粒体数量持续减少及功能障碍，导致血管内皮细胞凋亡。本研究电镜结果显示：X射线辐射后HUVECs线粒体损伤严重且数量减少，细胞质中出现较多ASS，而中和高剂量的UFE-AH使线粒体肿胀减轻和数量增加，ASS减少，提示UFE-AH可改善线粒体损伤，同时可能通过调节自噬来维持细胞内稳态，达到抗辐射损伤作用，然而其确切机制需要进一步研究。

综上所述，UFE-AH对X射线引起的血管内皮细胞损伤具有保护作用，其机制可能是通过上调血管内皮细胞中PI3K、p-Akt、VEGF和Bcl-2蛋白表达，下调Bax和caspase-3蛋白表达，抑制血管内皮细胞凋亡，减轻受损血管内皮细胞超微结构改变，发挥其抗辐射损伤的作用，本研究结果为X射线辐射防护剂的研发和临床应用提供了新的方向。