原发性膝骨关节炎患者血浆cf-DNA/NETs的检测水平及临床意义

白亚平，王 倩，严亚玲，张 喻，李 宁，白巧丽，党丽丽（空军军医大学西京医院骨科，西安 710032）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是多发于中老年人群的一种慢性退行性疾病，由膝关节软骨退变损伤、剥落为病理特点，临床主要表现为膝关节疼痛及功能障碍，严重影响患者正常生活[1-2]。KOA可分为原发性KOA和继发性KOA，继发性KOA通常是关节局部在由外伤、先天畸形等所致的关节损伤病变基础上形成，原发性KOA的发病机制尚不明确[3]。中性粒细胞是组成机体免疫系统的主要成员之一，受到刺激后产生中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），NETs由骨架脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和镶嵌其中的抗微生物颗粒蛋白组成，是中性粒细胞吞噬清除病原体新发现的途径[4]。NETs使粒细胞蛋白和DNA在肽基精氨酸脱氨酶4和弹性蛋白酶介导下进入胞外环境的杀菌机制已被广泛报道[5]，但与原发性KOA的临床研究鲜见报道。本研究旨在探讨原发性KOA患者血浆中游离DNA（circulating free DNA，cf-DNA）/NETs水 平 的 临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取空军军医大学西京医院2020年3月～2021年8月收治的192例原发性KOA患者作为观察组，其中男性81例，女性111例，年龄50～80（62.18±7.38）岁，体质量指数（body mass index，BMI）19～26（23.26±2.56）kg/m2，吸烟史47例，家族遗传史21例。纳入标准：①符合《骨关节炎诊疗指南(2018年版)》中KOA诊断标准[6]；②单膝发病；③年龄50～80岁。排除标准：①有心、肝、肾等重要脏器功能不全者；②继发性KOA；③伴自身免疫性疾病者；④近6个月接受药物或手术治疗者。根据凯尔格伦-劳伦斯（Kellgren-Lawrence，K-L）分级标准[6]将观察组分为四个亚组：39例原发性KOA Ⅰ组（可疑骨赘）、57例原发性KOAⅡ组（明确骨赘，但未累及关节间隙）、63例原发性KOA Ⅲ组（关节间隙中度狭窄）和33例原发性KOA Ⅳ组（关节间隙明显狭窄，软骨下骨硬化）。另外选取同期体检健康人群200例作为对照组，其中男性97例，女性103例，年龄49～78（62.16±7.32）岁，B M I 1 9～2 6（2 3.0 1±2.4 7）k g/m2，吸烟史55例。对照组和观察组性别、年龄、BMI，吸烟史比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本次研究通过医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 离心机（广州吉迪仪器有限公司，型号JIDI-4M），多功能酶标仪（美国Thermo公司，型号Varioskan Flash），PicoGreen荧光染料（南通飞宇生物科技有限公司，批号FY19275）。

1.3 方法

1.3.1 PicoGreen荧光染料法检测血浆cf-DNA/NETs水平：观察组于确诊后治疗前、对照组于体检时，清晨抽取空腹静脉血5 ml，置于含枸橼酸钠的抗凝管中，将血液样本在4℃低速离心10 min（4 800 r/min）分离血浆，置-70℃保存。检测时将100 μl复温后血浆样本与100 μl PicoGreen荧光染料混合，避光孵育5 min，采用多功能酶标仪检测荧光值并绘制标准曲线，以此计算标本血浆中cf-DNA/NETs水平。

1.3.2 病情严重程度评定：原发性KOA患者于确诊后在治疗前根据西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（Western Ontario and McMaster University Osteoarthritis Index，WOMAC）量表[7]从疼痛、僵硬、关节功能三个方面评估原发性KOA症状严重程度，分值越高对应病情越严重，记录观察组WOMAC评分。

1.4 统计学分析 采用SPSS24.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数表示，采用卡方检验；Pearson分析原发性KOA患者血浆cf-DNA/NETs水平与K-L分级。WOMAC评分的相关性；多因素Logistic回归分析影响原发性KOA发病的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组、观察组血浆cf-DNA/NETs水平比较与对照组（86.52±16.25ng/ml）比较，观察组血浆cf-DNA/NETs（932.94±106.66ng/ml）水平较高，差异有统计学意义（t=110.901，P=0.000）。

2.2 原发性KOA患者各亚组血浆cf-DNA/NETs水平比较 原发性KOA Ⅰ组、原发性KOA Ⅱ组、原发性KOA Ⅲ组和原发性KOA Ⅳ组血浆cf-DNA/NETs水 平 依 次 升 高（836.54±93.18ng/ml，905.29±94.46ng/ml，950.33±117.85ng/ml，1 061.40±122.29ng/ml），差异有统计学意义（F=28.011，P＜0.05）。原发性KOAⅡ组、原发性KOAⅢ组、原发性KOAⅣ组与原发性KOA Ⅰ组比较（t=4.126, 7.511, 12.786），原发性KOAⅢ组、原发性KOAⅣ组与原发性KOA Ⅱ组比较（t=3.682,9.906），原发性KOAⅣ组与原发性KOA Ⅲ组比较（t=6.952），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 原发性KOA患者血浆cf-DNA/NETs水平与K-L分级相关性分析 见图1。Pearson分析结果显示，观察组血浆cf-DNA/NETs水平与K-L分级呈正相关（r=0.552，P=0.000），K-L分级越高，血浆cf-DNA/NETs水平越高。

图1 原发性KOA患者血浆cf-DNA/NETs水平，K-L分级散点图

2.4 原发性KOA患者血浆cf-DNA/NETs水平与WOMAC评分相关性 观察组WOMAC总评分为61.68±10.67分，其中疼痛评分为11.97±2.84分，僵硬评分为3.87±1.16分，关节功能评分为45.84±6.67分。Pearson相关分析结果显示，观察组血浆cf-DNA/NETs水平与疼痛评分、僵硬评分、WOMAC总评分无相关性（r=0.107, 0.153, 0.200；P=0.515, 0.314, 0.459），与关节功能评分呈正相关（r=0.627，P=0.000）。

2.5 影响原发性KOA发病的多因素Logistic回归分析 见表1。以是否患有原发性KOA为因变量，以性别、年龄、BMI，吸烟史、家族遗传史、血浆cf-DNA/NETs水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果表明，年龄、吸烟史、家族遗传史、血浆cf-DNA/NETs水平均是原发性KOA发病的危险因素（均P＜0.05）。

表1 影响原发性KOA发病的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的网状结构能够诱捕病原体，减少其扩散至血液，同时NETs骨架DNA上的大量抗菌蛋白，对病原体起到有效的防御作用[8-9]，但调节功能紊乱时，NETs对机体组织造成损伤[10]。NETs的形成以胞外DNA水平增加为标志，已被证实和多种疾病相关[11-12]。孟强等[13]研究发现，与非感染全身炎性反应综合征患者相比，脓毒症患者血浆cf-DNA/NETs水平较高，对于脓毒症有一定诊断价值，能反映脓毒症患者病情发展程度，高水平的cf-DNA/NETs对于脓毒症患者预后发生死亡事件有一定预测价值。白塞病（即贝赫切特综合征）是全身性免疫系统疾病的一种，属于慢性血管炎，研究发现[14]，白塞病患者血管炎及血栓形成区域检测到NETs，活动期白塞病患者血清cf-DNA水平与非活动期白塞病患者、健康体检者比较均较高；血管受累白塞病患者血清cf-DNA水平较无血管受累白塞病患者高，NETs可能与促凝血有关，有成为减少或预防白塞病血栓形成风险的潜在治疗靶点。张慧等[15]研究发现，NETs对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖产生促进作用，随着NETs水平升高，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖能力越强，NETs经脱氧核糖核酸酶Ⅰ预处理后，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的促增殖作用受到抑制，该机制可能是类风湿关节炎患者的主要致病原因，也是一个治疗的新思路。

本研究结果发现，原发性KOA患者血浆cf-DNA/NETs水平高于体检健康人群，与孟强等[13-14]，研究结果相似，提示cf-DNA/NETs可能参与原发性KOA的发生。进一步研究发现，原发性KOA Ⅰ组、原发性KOA Ⅱ组、原发性KOA Ⅲ组和原发性KOA Ⅳ组血浆cf-DNA/NETs水平依次升高，提示cf-DNA/NETs参与原发性KOA的发展，原因可能是免疫应答过程产生过量NETs，未能有效清除，高水平的NETs对膝骨关节造成损伤。Pearson相关分析结果显示，原发性KOA患者血浆cf-DNA/NETs水平与K-L分级、关节功能评分均呈正相关，与疼痛评分、僵硬评分、WOMAC总评分无相关性，提示血浆cf-DNA/NETs水平可以反映原发性KOA患者病情严重程度及关节日常活动功能障碍。

KOA患者的膝关节软骨损伤存在不可逆性，治疗困难，病因及发病机制尚未阐明，因此控制危险因素以减少发病率具有重要临床意义[16-18]。研究表明性别、年龄、BMI，吸烟史均是KOA发病的危险因素[19]。王欢等[20]调查发现女性原发性KOA发病率高于男性，原发性KOA发病率与年龄呈正相关。郭利刚等[21]研究发现，原发性KOA患者与健康体检者同性别上胫腓关节面坡度相比差异均有统计学意义，上胫腓关节面坡度与K-L分级呈正相关，是原发性KOA发病的危险因素。易志勇等[22]从基因多态性的角度分析发现，KOA患者ERa基因Xba Ⅰ多态性位点的等位基因x频率分布较健康人群高，ERa基因Xba Ⅰ多态性位点的x等位基因与KOA的发生有一定关系。本研究结果发现，年龄、吸烟史、家族遗传史、血浆cf-DNA/NETs水平均是原发性KOA发病的危险因素，提示可通过控制上述危险因素预防原发性KOA的发生，除了既往研究报道的危险因素年龄、吸烟史、家族遗传史外，还应关注血浆cf-DNA/NETs水平升高的患者，以便能及时采取措施治疗原发性KOA。

综上所述，cf-DNA/NETs在原发性KOA患者血浆中呈高表达，血浆cf-DNA/NETs水平与原发性KOA的发生及病情发展密切相关，是原发性KOA发病的危险因素，检测其水平可为原发性KOA的预防及治疗提供参考依据，具体机制尚需进一步研究。