2型糖尿病肾病患者外周血E-选择素表达水平及其基因G98T和A561C位点多态性与代谢指标的相关性研究

鲁文菊，宫艳艳，高 霞，惠 蓉

（1.陕西省人民医院a.内分泌科；b.检验科；c.第三临床部，西安 710068；2.延安大学医学院，陕西延安 716000）

《中国2型糖尿病防治指南（2020版）》指出，糖尿病在中国的发病率为11.2%。其中胰岛素抵抗或者胰岛素进行性分泌不足引起的2型糖尿病，占糖尿病总人数90%以上[1]。糖尿病患者伴有高血脂、高血压、高血糖等危险因素，其中糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是最严重的并发症，也是其死亡的常见原因之一[2-3]。目前传统的诊断方法在各方面存在一些不足之处，例如尿清蛋白受药物等因素的影响，会造成假阳性和假阴性[4]；肾活检有出血风险和局部取样不足等缺点[5]；尿微量清蛋白在早期正常，会造成漏诊[6]。E-选择素(E-selectin)是黏附分子选择素家族中的重要成员，在介导肿瘤细胞、血管内皮细胞之间的黏附中起重要作用[7]。近年已有研究证实血清可溶性 E-选择素表达增加与糖尿病的发病密切相关[8-9],但 E-选择素及其基因多态性与糖尿病肾病的相关性尚需进一步研究。本文拟分析2型糖尿病肾病患者血清E-选择素表达水平及其基因多态性，以及其与代谢指标的相关性，进一步揭示E-选择素及其基因多态性在2型糖尿病肾病中的作用机制，为临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究纳入2020年9月～2021年10月在陕西省人民医院接受治疗的2型糖尿病肾病患者203例为糖尿病肾病组，其中男性109例（53.7%），女性94例（46.3%），平均年龄58.93±12.35岁。同期健康体检者40例作为对照组，其中男性21例（52.5%），女性19例（47.5%），平均年龄57.33±10.24岁。二组受试者平均年龄、性别比例之间差异无统计学意义（P＞0.05）。2型糖尿病肾病患者纳入标准：①符合1999年WHO糖尿病诊断及分型标准；②出现血肌酐超过167μmol/L、尿蛋白定量超过0.5g/24h或者两次以上蛋白尿排泄率超过30mg/24h。排除标准：①有冠心病、高血压、糖尿病、过度肥胖等疾病家族史患者；②有严重系统性疾病患者。糖尿病肾病组患者按照糖尿病肾病分期（Mogensen）标准再分为5组：其中I期患者39例（AⅠ组）、Ⅱ期患者42例（AⅡ组）、Ⅲ期患者40例（AⅢ组）、Ⅳ期患者47例（AⅣ组）和Ⅴ期患者35例（AⅤ组）。本研究已通过陕西省人民医院伦理委员会的批准，且纳入研究的对象均已签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 主要仪器：日立7060型全自动生化分析仪、紫外分光光度计（英国，Gene Company Limited），PCR反应仪（德国，PeQLab公司），凝胶电泳仪（英国，Biochrom公司），紫外线凝胶成像系统（英国，Gene Company Limited），离子交换高压液相色谱仪（美国，High Pressure Liquid Chromatography, HPLC）。主 要 试 剂：E-选 择 素ELISA试剂盒（上海研生生化试剂有限公司）；DNA快速提取试剂盒、DNA marker，PCR扩增试剂盒（海捷瑞生物工程有限公司）；FastDigestPst I，FastDigestHph I（宝生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及处理：二组受试者禁食12h后，采集当日清晨空腹静脉血，其中3ml EDTA抗凝血用作DNA提取及糖化血红蛋白（HbAlc）检测。另外3ml血样用作临床代谢指标检测，包括：血清可溶性E-选择素水平、三酰甘油（TG）、血清总胆固醇（TC）、血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）、空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素(FINS)。计算胰岛素抵抗指数（Homa-IR）：

1.3.2 E-选择素检测：使用酶联免疫吸附法测定血清可溶性E-选择素水平，具体操作严格按照试剂说明书进行。

1.3.3 E-选择素基因G98T和A561C位点多态性检测：标本DNA提取：首先提取所有受试者的全血中的DNA，使用紫外分光光度法测定提取DNA的纯度，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性程度，上述步骤均参考文献[10]进行。

PCR 引物准备：查阅文献，应用引物设计软件Premier5.0，设计E-选择素基因G98T和A561C位点引物：G98T上游引物为5'-TGC-CCA-AAATCT-TAG-GAT-3'，下游引物为5'-AAG-CCC-AGGAAG-AAC-ACA-3'；A561C上游引物为5'-AGTAA TAGTCCTCCTCATCAT-3'，下游引物为5'-ATC-TC A-AGT-GAA-GAA-AGA-3'。

PCR反应体系组成：2.5μl 10×PCR Buffer，2.0μl 2.5mmol/L dNTPs和20 pmol引物，5.0μl模板DNA，1.25U Taq DNA聚合酶。

PCR 扩增循环参数：94℃预变性5min，之后进入30个变性-退火-延伸的循环中，其中变性温度94℃、退火温度59 ℃、延伸温度72℃，末次循环结束后再延伸温度72℃下维持5min。

PCR扩增产物酶切及电泳：本研究设定的酶切反应体积为20μl，其中包括15μl PCR反应体系，2μl 10×酶切Buffer，0.2μl PST限制性核酸内切酶，2.8μl无菌水。该酶切反应体系经振荡混匀及离心操作后进行水浴过夜（37℃），次日取3μl酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳（先150 V电压下电泳5min，后转成100V电压电泳30min）,之后利用紫外线凝胶成像系统确定电泳结果。

E-选择素基因G98T以及A561C位点基因基因型的具体电泳带分析标准[10-11]见表1。

表1 电泳带分析标准

1.4 统计学分析 采用 SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，计数资料以百分率(%)表示。两组比较采用t检验，多态性位点基因型频率使用Hardy-Weinberg遗传平衡定理进行检验，相对风险度使用比值比（OR）和95%可信区间（CI）表示。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者代谢指标及E-选择素水平比较 见表2。糖尿病肾病组BUN，Cr，TG，TC，FPG，HbAlc，FINS，E-选择素水平及HOMA-IR水平均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组受试者代谢指标及E-选择素水平比较(±s)

表2 两组受试者代谢指标及E-选择素水平比较(±s)

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2.2 2型糖尿病肾病患者不同分期的代谢指标及E-选择素水平比较 见表3。2型糖尿病肾病患者BUN，Cr，TG，TC，FPG，HbAlc，FINS，E-选择素水平及HOMA-IR结果随糖尿病肾病疾病严重程度增加而升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 2型糖尿病肾病患者不同分期的代谢指标及E-选择素水平比较(±s)

表3 2型糖尿病肾病患者不同分期的代谢指标及E-选择素水平比较(±s)

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2.3 两组受试者E-选择素G98T位点及A561C位点基因型及等位基因分布情况 见表4。E-选择素G98T位点及A561C位点的基因型及基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定理（P＞0.05）。糖尿病肾病组E-选择素G98T位点GT, TT基因型及T等位基因出现的频率明显高于对照组，而GG基因型和G等位基因出现的频率明显低于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。糖尿病肾病组E-选择素A561C位点AC, CC基因型及C等位基因频率明显高于对照组，AA基因型和A等位基因频率明显低于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表4 两组受试者 E-选择素G98T位点及A561C位点基因型及等位基因分布情况[n(%)]

2.4 2型糖尿病肾病E-选择素水平及其基因多态性与代谢指标相关性分析 见表5。研究发现BUN，Cr，TG，TC，FPG，HbAlc，FINS和HOMA-IR与2型糖尿病肾病患者E-选择素水平及E-选择素G98T位点TT基因型，A561C位点CC基因型之间均呈现正相关（均P＜0.05）。

表5 2型糖尿病肾病E-选择素及其基因多态性与糖脂代谢指标相关性分析(r)

2.5 影响2型糖尿病肾病患者严重程度的多因素Logistic回 归 分 析 见 表6。以BUN, Cr, TG, TC,FPG, HbAlc, FINS, HOMA-IR和E-选 择 素 水 平 及E-选择素G98T位点TT基因型，A561C位点CC基因型指标为自变量进行分析。结果显示BUN, Cr,TG, TC ,FPG, HbAlc, FINS, HOMA-IR, E-选择素水平及E-选择素G98T位点TT基因型，A561C位点CC基因型均为2型糖尿病肾病的独立危险因素。

表6 影响2型糖尿病肾病患者严重程度的多因素Logistic回归分析

3 讨论

2型糖尿病肾病病因复杂，肾脏血流动力学改变、糖代谢紊乱、激素和细胞因子作用、慢性炎症反应引起长期炎症损伤及细胞浸润、遗传因素等与发病有关[12]。有研究表明E-选择素基因序列中存在S128R，G98T及A561C的基因多态性位点，与脑卒中、乙型肝炎、心绞痛等疾病的发生发展过程密切相关[13-15]。E-选择素基因位于第 l 号染色体的长臂上,为一段长 13kb 的 DNA 序列,包含14 个外显子和 13 个内含子，它表达于炎症部位的内皮细胞。它有介导活化内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞黏附作用，此黏附作用既不依赖于白细胞的活化，也不需要白细胞整合素的参与。在内皮细胞表面进行最初的滞留和滚动，随后迁移到炎症组织。E-选择素具有组织特异性和细胞因子可诱导性，参与炎性反应、介导起始黏附[16]，可能与糖尿病肾病发生发展相关。

本研究结果显示，糖尿病肾病组BUN, Cr, TG,TC ,FPG, HbAlc, FINS, HOMA-IR和E-选择素水平高于对照组，且随糖尿病肾病疾病严重程度的增加而升高，同时E-选择素水平与上述代谢指标呈正相关，与刘艳秋等[17]研究发现：E-选择素与HOMAIR高度相关，可能通过胰岛素抵抗促进T2DM发生的结果一致。分析其原因可能是因为体内E-选择素水平会通过直接或者间接的方式影响糖尿病肾病患者的血糖代谢及血脂代谢。另外本研究还发现糖尿病肾病组E-选择素G98T位点GT，TT基因型及T等位基因出现的频率和A561C位点AC，CC基因型及C等位基因频率明显高于对照组，与冯雪飞等[10]研究结果相似，分析其原因可能是因为E-选择素第4外显子表皮生长因子区域结构存在的561位A向C突变，从而导致了所编码的第128位氨基酸由丝氨酸变成精氨酸，从而影响E-选择素基因表达。同样，E-选择素基因的第98位的核苷酸由G向T的突变同样可能影响该基因的表达和功能，进而影响糖尿病患者的糖脂代谢过程以及肝肾功能[14]。

通过Logistic回归分析显示BUN, Cr, TG, TC,FPG, HbAlc, FINS, HOMA-IR, E-选择素水平及E-选择素G98T位点TT基因型，A561C位点CC基因型均为2型糖尿病肾病的独立危险因素。提示E-选择素水平及E-选择素G98T位点TT基因型、A561C位点CC基因型均参与患者的代谢过程，可能引起机体代谢紊乱，加重了内皮细胞的损伤程度，引起了可溶性E-选择素的表达量明显增长，从而导致肾脏间质细胞的损伤进一步恶化。随着肾脏间质细胞损伤程度的加重，患者体内Cr和BUN水平会进一步升高。而E-选择素水平的增高会进一步加重糖尿病肾病患者的肾脏间质细胞损伤。

综上所述，2型糖尿病肾病患者的E-选择素水平及其基因G98T位点以及A561C位点基因多态性与代谢指标之间存在显著性相关关系，其中G98T位点T等位基因以及A561C位点C等位基因可能是导致2型糖尿病肾病发病的重要因素，可以作为糖尿病肾病患者病情监测的参考指标之一。但本研究并未对E-选择素基因G98T位点以及A561C位点基因多态性影响糖尿病肾病发病的具体机制进行展开研究，未来尚需进行深入探索。