Caspase-3和GSDME介导的细胞焦亡对子宫肌瘤细胞侵袭和迁移的影响*

谌媛媛， 胡银逢， 刘金龙

(1.安徽省医科大学第一附属医院 妇产科， 安徽 合肥 230022； 2.临泉县人民医院 神经外科, 安徽 临泉 236400)

子宫肌瘤是女性生殖系统常见的良性肿瘤，通常以切除子宫为治疗手段，但是子宫切除不仅会导致患者的生育能力丧失，而且还有可能诱发盆底功能障碍性疾病[1-2]。因此，积极探寻子宫肌瘤的发病机制并给予相应的干预治疗可能是治疗子宫肌瘤的良好方式。细胞焦亡是一种细胞死亡方式，与凋亡和坏死在形成机制和细胞形态学上存在明显差异[3]。既往的研究显示Gasdermin蛋白家族与焦亡密切相关，其中消皮素E(gasdermin E，GSDME)依赖性细胞焦亡是肿瘤领域中研究最热的焦亡发生机制。GSDME又称DFNA5，是一个耳聋相关基因，由GSDME-C端和GSDME-N端结构域组成，2者相互结合后可起到抑制的作用[4-5]。有研究证实GSDME可以通过caspase-3切割获得活性，并诱导肿瘤细胞焦亡[6]。在肝癌细胞Bel-7402中，GSDME低表达，给予雷公藤甲素能够促进活化GSDME形成GSDME-N，诱导肝癌细胞焦亡[7]。另外，在结直肠癌Lovo细胞中，GSDME亦低表达，给予奥沙利铂能够促进GSDME表达，从而诱导结直肠癌细胞焦亡[8]。以上研究表明GSDME依赖性细胞焦亡在肿瘤发生中发挥重要作用。细胞侵袭和转移是肿瘤恶性病变的关键环节，而基因药物干预治疗改善肿瘤细胞的恶性病变与其抑制细胞侵袭和转移密切相关。但是目前有关细胞焦亡在子宫肌瘤中的研究较少，同时有关GSDME依赖性细胞焦亡对子宫肌瘤细胞侵袭和迁移的影响也尚不清楚。因此，本研究通过体外培养子宫肌瘤细胞，探讨GSDME依赖性细胞焦亡对细胞侵袭和转移的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞与试剂 DMEM培养基(美国Gibco公司)，293T细胞(中国科学院上海细胞库)，Transwell 小室(美国 Corning 公司)；细胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制剂、蛋白marker、BCA试剂盒、一抗稀释液、山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗稀释液和ECL发光试剂盒由碧云天生物技术公司提供，逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq以及TRIzol Reagent为日本TAKARA公司产品，Caspase-3小鼠单克隆抗体、GSDME兔单克隆抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品，批号9662、9047；β-actin小鼠单克隆抗体(碧云天生物技术公司，批号AF5001)。

1.1.2仪器 细胞匀浆仪(武汉泰普拓公司，型号TWK-FST32)，高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号Micro17R]，PCR仪(美国Bio-Rad伯乐，型号CFX384 Touch)，倒置荧光显微镜[日本尼康(Nikon)公司，型号GPJ9-TS100-F]，全自动多功能酶标检测仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号FC]，电泳仪(美国伯乐Bio-Rad公司，型号1658033)，ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1原代子宫肌瘤细胞培养 无菌条件下取手术切除并经病理学证实的子宫肌瘤组织或子宫平滑肌细胞1 cm3，放入4 ℃，无菌、含抗生素的PBS缓冲液转移至细胞培养室。PBS润洗并剪碎至小于1 mm3，离心、静置、去除上清液、加入Ⅰ型胶原酶(800 000 U/L)的DMEM培养基，于37 ℃消化成单个细胞并使用PBS终止消化，过滤细胞悬液，1 500 r/min离心10 min收集细胞，最后加入细胞培养基吹打混匀放置细胞培养箱内培养；细胞贴壁生长24 h， 观察细胞生长状态，细胞贴壁生长密度占培养瓶80%～90%时进行传代处理。

1.2.2GSDME慢病毒感染 构建GSDME和Vector质粒转化Ecoli DH5ɑ菌，挑选单克隆并提取质粒，转染包装293T细胞，收集足量的慢病毒液，稀释病毒液，4 ℃静置过夜，离心，去除上清液，并加入细胞培养基，过滤，收集慢病毒颗粒。取对数生长期的原代子宫肌瘤细胞，接种至培养皿内，实验分为空载体质粒组(Vector组)、转染GSDME载体质粒组(OVE-GSDME组)，感染10～12 h更换新鲜培养基继续培养，共计感染3次，荧光显微镜下观察各组细胞感染情况，以绿色荧光蛋白表示细胞感染率。

1.2.3实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-PCR) 按照RNA提取试剂盒说明书提取子宫肌瘤细胞或或子宫平滑肌细胞总RNA，并运用紫外分光光度计检测总RNA的浓度与纯度。以RNA为模板，参照逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA。再以cDNA为模板，根据广州锐博公司设计合成的 PCR引物进行扩增。扩增条件95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共计30个循环。引物序列：GSDME上游引物为5′-CGTAGAGAGCCAGTCTTCATTT-3′，下游引物为5′-GTTCCAGGACCATGAGTAGTTC-3′；Caspase-3上游引物为5′-AAGCCGAAACTCTTCATC-3′，下游引物为5′- TGAGCATTGACACAATACAC-3′；β-actin上游引物为5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游引物为5′-CCTGCTCACCACCTTCTTG-3′。采用7300 System SDS Software 分析数据，根据2-ΔΔCt值计算相对定量样本中目的基因的表达水平。

1.2.4Western blot检测GSDME表达 将子宫肌瘤细胞研磨并涡旋(5 min/次)，冰上裂解1 h；利用BCA法测定各组细胞蛋白质浓度，按照30 μg/孔上样浓度计算各组上样体积；制备浓缩胶与分离胶凝胶，上样；电泳90 min，湿转转膜120 min，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应GSDME兔单克隆抗体(1 ∶1 000)、caspase-3小鼠单克隆抗体(1 ∶1 000)及β-actin小鼠单克隆抗体(1 ∶2 000)，4 ℃过夜，孵育对应的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)1～2 h；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5 min/次，加入显影液显影并拍照。Caspase-3、GSDME蛋白表达水平以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值比值反映，以上实验均重复3次。

1.2.5细胞焦亡形态学观察 于400×光学显微镜下观察感染慢病毒后48 h时子宫肌瘤细胞的形态学变化。

1.2.6Transwell实验检测细胞侵袭能力和迁移能力 (1)侵袭实验：Transwell小室的滤膜采用ECM gel覆盖，小室加入内含10% FBS培养基0.5 mL，在上室中加入2×106/L浓度的细胞悬液，每孔200 μL，均设置3个复孔。细胞常规培养48 h，4%的多聚甲醛固定，结晶紫染色，于400×显微镜下随机选取5个视野观察穿过膜的细胞平均数；计算细胞侵袭指数，细胞侵袭指数=(各处理组侵袭细胞数/NC mimic组细胞数)×100%。(2)迁移实验：细胞常规处理，1 000 r/min离心5 min，重悬细胞并计数；将小室放置于24孔板内，并于下室加入完全培养基(10% FBS)，上室中加入1×105细胞，小室膜与培养基无气泡，将24孔板置于培养箱内继续培养48 h，取出培养板、PBS润洗小室并擦拭上室残留细胞，多聚甲醛固定约15 min，使用0.1%的结晶紫染色，洗涤、风干；于400×显微镜下随机选取5个视野进行拍照计数，计算细胞迁移指数，细胞迁移指数=(各处理组迁移细胞数/NC mimic组细胞数)×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞中caspase-3、GSDME mRNA表达水平

qRT-PCR结果显示，子宫肌瘤细胞中caspase-3、GSDME mRNA表达水平低于子宫平滑肌细胞，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2 GSDME过表达慢病毒感染子宫肌瘤细胞

荧光倒置显微镜下观察可见2组细胞中均有发出绿色荧光的细胞，提示有GSDME慢病毒感染，表明慢病毒介导的GSDME过表达载体构建成功。见图2。

注：(1)与Normal组相比，P<0.01。图1 子宫肌瘤细胞caspase-3、GSDME mRNA表达水平Fig.1 Caspase-3 and GSDME mRNA expression level of uterine fibroids cell

图2 GSDME过表达慢病毒感染子宫肌瘤细胞(100×)Fig.2 GSDME overexpression lentivirus infects uterine leiomyoma cells (100×)

2.3 GSDME过表达对子宫肌瘤细胞焦亡的影响

如图3所示：OVE-GSDME组子宫肌瘤细胞GSDME、GSDME-N、Caspase-3及cleaved-caspase-3蛋白表达水平均较Vector组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。显微镜下观察细胞焦亡现象，与Vector组子宫肌瘤细胞相比，OVE-GSDME组细胞出现典型的细胞焦亡形态，主要表现为细胞体积增大，并向一侧“吹泡”，且检测乳酸脱氢酶(LDH)释放度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注：(1)与Vector组相比，P<0.01。图3 Caspase-/GSDME信号通路蛋白表达水平Fig.3 Protein expression level of Caspase-/GSDME signaling pathway

注：红色箭头表示焦亡细胞，(1)与Vector组相比，P<0.01。图4 子宫肌瘤细胞焦亡形态学变化及LDH释放(400×)Fig.4 Morphological changes of pyroptosis and LDH release of uterine fibroids (400×)

2.4 GSDME过表达对子宫肌瘤细胞侵袭和迁移的影响

Transwell实验检测结果显示，OVE-GSDME组子宫肌瘤细胞侵袭和迁移指数均较Vector组细胞明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

注：A为侵袭实验，B为迁移实验，C为统计结果；(1)与Vector组相比，P<0.01。图5 GSDME过表达对子宫肌瘤细胞侵袭和迁移的影响Fig.5 Effect of GSDME overexpression on the invasion and migration of uterine fibroids cell

3 讨论

子宫肌瘤是一种常见的妇科疾病，对生育能力有着严重的影响。临床研究发现，子宫肌瘤具有较高的发病率[9]。目前有关子宫肌瘤的临床治疗主要包括药物治疗和手术治疗，但是药物治疗存在副作用较大、手术治疗存在创伤较大的缺点[9]。因此积极探寻子宫肌瘤的发病机制并给予相应的干预治疗尤为关键。

GSDME依赖性细胞焦亡是肿瘤细胞死亡的一种新形式。既往研究显示在多种肿瘤细胞中GSDME呈低表达，而使用化疗药物后能够促进GSDME表达，诱导肿瘤细胞焦亡，从而增加肿瘤细胞的化疗敏感性[10-12]。因此，通过调控GSDME依赖性细胞焦亡已经成为治疗肿瘤恶性病变的又一新机制。目前有关GSDME依赖性细胞焦亡对子宫肌瘤的发生发展影响及其作用机制尚不清楚。为此，本研究首先通过qRT-PCR检测子宫肌瘤细胞caspase-3、GSDMEmRNA表达。结果显示与正常的子宫平滑肌细胞相比，子宫肌瘤细胞caspase-3、GSDMEmRNA呈低表达。本研究结果与以往研究发现结直肠癌、胃癌等细胞GSDME呈低表达一致[13-14]。化疗药物顺铂能够增加结直肠癌细胞GSDME过表达对顺铂化疗药物的敏感性[15]。另外，吉西他滨能够激活Caspase-3/GSDME途径诱导胰腺癌细胞焦亡[16]。以上研究提示过表或是激活GSDME细胞焦亡途径能够促进肿瘤细胞死亡，从而改善肿瘤疾病进展。为此，本研究进一步通过构建GSDME过表达慢病毒，观察GSDME对子宫肌瘤细胞焦亡的影响。结果显示2组细胞均可见慢病毒包装系统细胞发出绿色荧光，表明慢病毒介导的GSDME过表达成功。Western blot检测结果显示，与Vector组相比，OVE-GSDME组细胞GSDME、GSDME-N、Caspase-3及cleaved-caspase-3蛋白表达明显升高。显微镜下观察细胞焦亡现象，与Vector组相比，OVE-GSDME组细胞出现典型的细胞焦亡形态，主要表现为细胞体积增大，并向一侧“吹泡”且LDH释放度显著升高。以上研究表明过表达GSDME能够诱导子宫肌瘤细胞焦亡发生。那么有关GSDME依赖性细胞焦亡对子宫肌瘤细胞恶性病变的机制又是如何呢？肿瘤细胞侵袭和迁移是其恶性病变的关键[17]。伴随肿瘤细胞侵袭和迁移的发生远处正常组织和细胞亦会发生癌变[18]。因此，通过抑制肿瘤细胞的侵袭和转移是改善肿瘤患者恶性病变的关键。本研究通过Transwell小室实验检测OVE-GSDME组子宫肌瘤细胞侵袭和迁移指数，结果显示与Vector组相比，OVE-GSDME组子宫肌瘤细胞侵袭和迁移指数均显著降低，表明激活GSDME依赖性细胞焦亡能够通过抑制子宫肌瘤细胞侵袭和迁移从而改善子宫肌瘤的恶性病变。但是本研究未能揭示GSDME依赖性细胞焦亡对子宫肌瘤细胞侵袭和迁移的分子机制。PI3K/Akt信号传导与肿瘤细胞的恶性病变密切相关[19-21]。既往研究显示抑制PI3K/Akt信号传导能够抑制肿瘤细胞侵袭和迁移[22-25]。基于以上后期课题组将继续探究GSDME依赖性细胞焦亡能够通过调控PI3K/Akt信号从而抑制子宫肌瘤细胞侵袭和迁移。

综上所述，本研究通过探究GSDME依赖性细胞焦亡对子宫肌瘤细胞侵袭和迁移的影响。结果显示激活GSDME依赖性细胞焦亡能够抑制子宫肌瘤细胞侵袭和迁移。以上研究结果进一步丰富了子宫肌瘤的发病机制。