斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-10表达的特点*

赵砚驰， 李化， 李丹， 孔鹏， 张乙进， 吴洁玲， 莫大双， 舒莉萍*

(1.贵州医科大学 基础医学院 免疫学教研室, 细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室, 贵州省再生医学重点实验室, 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室, 贵州 贵阳 550004； 2.中国医学科学院 成体干细胞转化研究重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)是一种内源性细胞因子、于1989年被发现，因其能够抑制辅助性T细胞1(Th1 cell)的激活并影响促炎性细胞因子[如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)、白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)及白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)]的活化，被称为抗炎性细胞因子，在体液免疫与细胞免疫中起着重要作用[1-5]。IL-10由树突状细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)、单核细胞及巨噬细胞等产生，与相应受体结合后，导致非受体酪氨酸激酶1(janus kinase 1，JAK1)活化，激活信号传导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通过旁分泌与自分泌作用于树突状细胞与巨噬细胞，抑制Th2细胞发挥功能，同时影响过敏反应的发生[6-8]。有研究报道，IL-10能激活肥大细胞，并增强T淋巴细胞(T-lymphocyte，T cell)、B淋巴细胞(B-lymphocyte，B cell)和NK细胞的功能[9-11]；还发现IL-10抑制抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，APC)激活从而抑制T细胞发挥功能，诱导肿瘤免疫逃逸[12]；IL-10还可以直接或间接激活NK细胞，增强对肿瘤的杀伤作用[13]，因此IL-10在肿瘤免疫中有着双向调节作用，IL-10的功能及机制研究也受到越来越多的关注。IL-10在妊娠中维持胚胎正常发育同样起着重要作用[14]，有研究报道在正常妊娠过程中，滋养层细胞会分泌IL-10抑制淋巴细胞的增殖，进而使得滋养层细胞免受淋巴细胞的杀伤[15]；抑制IL-10的分泌，将会促进Th1细胞的增高，抑制Th2细胞的分泌，最终成为导致胚胎停止发育的重要原因之一[16]。既往IL-10相关研究已在小鼠、兔子等动物模型中进行了探索[17-18]，但因小鼠和兔子具有饲养成本高昂、繁殖周期较长以及胚胎宫内发育等特点，无法清晰直观且批量高效地探究IL-10在动物体内的变化情况。斑马鱼作为模式动物具有体型小、繁殖能力强、饲养繁殖较容易、体外受精以及所产胚胎透明易于观察等优势，其基因组又与人类基因高度相似[19-20]；且尚未有报道斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-10的表达情况，因此本研究通过同线性分析斑马鱼与人类及小鼠IL-10基因在染色体中的位置，将斑马鱼与不同物种进行氨基酸序列同源性比较，探究斑马鱼胚胎早期发育过程中IL-10的表达形式，为IL-10相关疾病研究提供实验与理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 使用野生型斑马鱼(Tüebingen品系)4～72受精后小时 (hourspost-fertilization，hpf)的胚胎，该品系为实验室自行繁育[合格证号SYXK(黔)2018-0001]；pCS2+载体(pCS2+vector)载体由本实验室提供，大肠杆菌(Escherichiacoil，E.coli)DH5α感受态细胞(北京天根生化)。

1.1.2主要试剂 2×Taq 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)预混液剂(北京天根生化)，First Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶NotⅠ和限制性内切酶EcoRⅠ、T4DNA连接酶(T4 DNA ligase)及NucAwayTMSpin Columns(美国ThermoFisher)，T3聚合酶(T3 RNA Polymerase，美国Promega)，Anti-Digoxigenin-AP(德国Roche)，原位杂交染色试剂盒BCIP / NBT(美国Vector Lab)，TRIzol Reagent(美国ambion)。

1.1.3主要仪器 分子杂交箱HL-2000(美国UVP)，梯度PCR仪etc811(北京东胜创新生物)，超微量生物检测仪nanodrop(美国ThermoFisher)，体视显微镜SMZ25(日本尼康)。

1.2 实验方法

1.2.1不同物种IL-10基因同源性分析(synteny analysis)及氨基酸序列同源性分析并绘制系统进化树 在美国国家生物信息技术中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库中分别查询IL-10基因在斑马鱼、人类及小鼠染色体中的位置，与Ensemble数据库中的数据进行比较，分别分析人类、斑马鱼、小鼠、大鼠、家兔、鸡、袋鼠、牛、黑猩猩、猕猴、红鳍鲀以及鲢鱼的IL-10氨基酸序列，通过多重序列比对软件(multiple sequence alignment，DNAMAN)对氨基酸序列相似性进行比对；使用分子进化遗传分析软件(molecular evolutionary genetics analysis X，MEGA X)分析系统进化树，以及Neighbor-joining算法进行评估。

1.2.2斑马鱼及胚胎养殖 野生型斑马鱼养殖在室温(26±2)℃且12 h/12 h照明的循环水系统中，使用胚胎培养液(0.06 g/L海盐、0.5 mg/L亚甲基蓝)对斑马鱼胚胎进行培养。

1.2.3斑马鱼总RNA提取及互补脱氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)合成 分别收集3组72 hpf的斑马鱼胚胎90枚(30枚/组)，使用TRIzol试剂对胚胎样本进行处理，经氯分相后使用异丙醇将RNA沉淀，洗涤并晾干后加入无酶水溶解；将上述总RNA进行逆转录得到cDNA，置于-20 ℃保存。

1.2.4地高辛标记的IL-10反义信使RNA(messenger RNA，mRNA)探针制备 根据斑马鱼IL-10基因序列使用Snap Gene软件设计引物：F为CCGGAATTCGGAGACCATTCTGCCAACA(划线位置表示添加的EcoRⅠ位点及保护碱基序列)，R为ATAGTTTAGCGGCCGCCATTTCACCATATCCCGCT(划线位置表示添加的NotⅠ 位点及保护碱基序列)。使用EcoRⅠ与NotⅠ将pCS2+载体与扩增所得IL-10片段进行双酶切，使用T4DNA连接酶将两者产物进行连接得到重组质粒pCS2+-IL-10，将重组产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定与测序鉴定，鉴定无误后将重组质粒线性化，使用T3转录体系进行体外转录后，纯化所得反义mRNA探针，置于-80 ℃冻存。

1.2.5斑马鱼多时相整胚原位杂交 分别收集4、6 、9 、12、18、24、48及72 hpf的斑马鱼胚胎75枚(25枚/组、3组)，4%多聚甲醛(paraformaldehyde fixative solution，PFA)固定胚胎过夜，使用甲醇梯度脱水于-20 ℃保存；原位杂交第1天时会将其中48和72 hpf的胚胎需用蛋白酶K处理；所有时相胚胎置于分子杂交箱中68 ℃预杂交4 h，加IL-10反义mRNA探针杂交14 h；第2天柠檬酸钠(saline sodium citrate，SSC)缓冲液洗涤，加anti-DIG-AP(1 ∶5 000)于4 ℃孵育16 h；第3天用含Tween-20的马来酸缓冲液(maleic acid buffer-tween，MABT)洗涤后加入新鲜配置的BCIP/NBT染液，避光染色直至阳性杂交信号出现后立即使用含Tween的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline tween，PBST)洗涤终止染色，4%PFA固定；在体视显微镜下观察IL-10的阳性杂交信号。

2 结果

2.1 不同物种间的同源性分析

同源性分析结果显示，IL-10基因位于斑马鱼11号染色体上，其上下游存在5个基因组序列与人类1号染色体、小鼠1号染色体上能找到相对应的同源区(图1)；人类、斑马鱼、小鼠、猕猴、牛及家兔等12个物种IL-10氨基酸序列相似性比对结果表明，斑马鱼与人类、小鼠、猕猴、牛和家兔等12个物种的IL-10氨基酸序列相似度较高(图2)；使用MEGA X绘制12个物种的IL-10系统进化树，结果表明在斑马鱼IL-10进化过程中与哺乳类动物具有保守性(图3)。

图1 人类、斑马鱼及小鼠染色体中IL-10基因的同源性分析Fig.1 Synteny analysis of IL-10 gene in human, zebrafish, and mouse chromosomes

注：英文字母表示不同氨基酸序列，数字表示氨基酸序列号，*表示相同氨基酸序列，.或∶表示不同相似程度的氨基酸序列，-表示该物种与其余物种对比缺失的氨基酸序列片段。图2 不同物种中IL-10的氨基酸序列比对结果Fig.2 Alignment of IL-10 amino acid sequences from multiple species

注：结点上方数字为自展值，表示该进化分支的可信度。图3 不同物种间IL-10的进化树Fig.3 Phylogenetic tree of IL-10 in multiple species

2.2 pCS2+- IL-10重组质粒构建及鉴定

氨苄抗性筛选的pCS2+-IL-10重组质粒经过限制性内切酶双酶切后，结果显示目标条带正确，并将正确的质粒进行测序鉴定，将测序结果与已知斑马鱼IL-10基因序列比对，结果保持一致。见图4和图5。

注：M为DNA Marker Ⅲ，泳道1为IL-10 RT-PCR产物，泳道2为 pCS2+- IL-10图4 pCS2+- IL-10重组质粒EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切产物的电泳鉴定Fig.4 Electrophoresis result of pCS2+-IL-10 recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and NotⅠ enzyme

注：红色方框表示所选取限制性内切酶及碱基序列，红色箭头表示所选取限制性内切酶位点；红色曲线表示胸腺嘧啶，绿色曲线表示腺嘌呤，蓝色曲线表示胞嘧啶，黑色曲线表示鸟嘌呤。图5 pCS2+-IL-10重组质粒的测序结果Fig.5 Sequencing result of pCS2+- IL-10 recombinant plasmid

2.3 野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中IL-10基因的表达模式

整胚原位杂交实验的结果显示(图6)，4～12 hpf时，野生型斑马鱼胚胎未观察到IL-10阳性杂交信号；18 hpf时，野生型斑马鱼胚胎中后部中间细胞群(intermediate cell mass，ICM)中观察到IL-10表达；24 hpf时，IL-10在野生型斑马鱼胚胎头部广泛表达，在其心脏及卵黄囊背侧表达尤为突出；48和72 hpf时，IL-10集中表达于野生型斑马鱼胚胎头部区域，在眼眶、心脏以及头部背侧表达尤为明显。

注：黑色箭头表示IL-10表达最为突出部位。图6 野生型斑马鱼胚胎发育不同时间点IL-10基因的表达(整胚原位杂交，×80)Fig.6 Expression of IL-10 during embryonic development of wild-type zebrafish at different time(the whole embryo in situ hybridization, ×80)

3 讨论

IL-10作为一种具有生物活性的小分子多肽，在免疫系统以及胚胎发育中都发挥重要的作用，可以由巨噬细胞、树突状细胞及各种T细胞亚群(Th1、Th2以及Th17)产生，其也能抑制Th1、Th2和Th17型T细胞发挥功能，存在负反馈调节抑制巨噬细胞与树突状细胞以及针对T细胞的激活[10,21-23]。有研究报道，妊娠妇女血清中IL-10水平明显高于正常妇女，并且复发性自然流产患者血清中IL-10水平低于正常妇女[24]；此外，IL-10在体外也能影响多种造血细胞生长和分化，IL-10缺陷的小鼠生长发育明显迟缓于正常小鼠，且伴有贫血以及肠道局部炎症[25-26]。然而相对系统的在斑马鱼早期胚胎发育过程中探究IL-10的表达情况，目前尚未有报道。

近年来，小鼠、兔子等动物已被广泛用于建立相关疾病模型，作为研究相关基因在疾病中机制与功能的方法，而斑马鱼在基因进化上具有高度保守性，使其逐渐成为一种理想的人类疾病研究的动物模型，同时也是研究遗传与发育的理想模型[27-28]。伴随例如成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)与吗啉代反义寡核苷酸(morpholino, MO)等技术的出现，使得多种斑马鱼疾病模型得以成功建立[29]，例如消化系统、神经系统以及血液系统疾病[30]。本研究通过分析斑马鱼胚胎早期发育中不同时期IL-10 mRNA的表达情况，有助于在相关疾病的斑马鱼模型中更好地探索IL-10的功能和作用。

本研究结果显示，斑马鱼IL-10氨基酸序列与人类IL-10氨基酸序列相似度较高，提示斑马鱼IL-10与人类IL-10功能相似，并且在进化过程中斑马鱼IL-10具有一定保守性。通过成功构建pCS2+-IL-10重组质粒，制备地高辛标记的IL-10反义mRNA探针，进而通过全胚胎原位杂交实验发现，4～12 hpf时未在斑马鱼胚胎中观察到IL-10阳性杂交信号，而18 hpf时开始，在斑马鱼胚胎ICM区域观察到IL-10阳性杂交信号；24、48及72 hpf时，IL-10表达于头部区域，在头部背侧、心脏、眼眶以及卵黄囊背侧部位表达尤为明显。由于ICM区域是斑马鱼胚胎发育的原始造血发生重要区域之一，与哺乳类动物胚胎中的卵黄囊相似，其中含有大量原始造血细胞，而源自于ICM的后部造血岛位于尾部腹侧区，标志着原始造血的结束，此外与斑马鱼胚胎髓系造血发育相关的转录因子在16～30 hpf造血前体细胞中表达，而斑马鱼血液循环开始于24 hpf[27,30]。因此根据实验结果提示IL-10可能与斑马鱼早期胚胎造血发育有着密切联系，在斑马鱼胚胎发育中发挥重要作用。

综上所述，本研究通过生物信息学分析了斑马鱼IL-10氨基酸序列在进化过程中具有相对保守性，并且通过全胚胎原位杂交实验发现IL-10的表达贯穿斑马鱼早期胚胎发育过程，提示IL-10可能在斑马鱼早期胚胎发育中发挥重要作用，为进一步探索IL-10在相关疾病中的功能与机制研究提供了实验基础。