关节解痛膏微生物限度检查方法学验证

储梅君，陈希，张银花，鄢雷娜

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

关节解痛膏为中药复方橡胶贴膏制剂。标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂（第十册）［1］，由辣椒、细辛、白芷、姜黄、生川乌、肉桂、生草乌、骨碎补、五加皮、天南星、红花、半夏、闹羊花、独活、防风、羌活、桑枝、海风藤、凤仙透骨草、芥子、防己、伸筋草、威灵仙、颠茄流浸膏、冰片、薄荷脑、水杨酸甲酯、樟脑、麝香草酚、二甲苯麝香、盐酸苯海拉明等三十一味药物组成。关节解痛膏为淡黄色的片状橡胶膏，气芳香，有活血，止痛，祛风，除湿的功效。可用于风寒湿痹、关节痛、神经痛、肌肉酸痛、腰痛、扭伤等病症的治疗［1-3］。本研究根据该品种的用药途径特点以及《中国药典》2020 年版微生物限度检查法对其用药途径的有关要求［2］，对控制菌（铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）的检查方法进行了实验，以建立适合于关节解痛膏的微生物限度检查方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AB2-4S1 型生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）；MZ-601 型集菌仪（杭州美卓生物科技有限公司）；MLS-3781L-PC 型高压蒸汽灭菌器（日本PHCbi 普和希）；HWS-250 型恒温恒湿培养箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；EVS2 型全封闭无菌检验过滤培养器（浙江泰林生物技术股份有限公司）；VITEK2compact 型自动微生物快速检测分析系统（法国生物梅里埃公司）。

1.2 培养基及试剂

所用培养基及试剂均经过适用性试验验证，符合《中国药典》2020 年版的要求，具体信息见表1。培养基均按说明书要求配制。本研究涉及的稀释液均为pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

表1 培养基信息表

上述培养基均按说明书要求配制。本文涉及的稀释液均为pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.3 菌种

菌种均源自中国医学菌种保藏中心，具体信息详见表2。试验菌株均为第二代。

表2 菌种信息表

1.4 样品

关节解痛膏（生产单位：江西吉安三力制药有限公司；批号：210402；规格：7×10 cm/贴）。

2 方法与结果

2.1 方法学验证试验

2.1.1 菌液制备 根据《中国药典》2020 年版四部通则1106“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”项下的规定［2］，制得每1 mL 含菌量分别不大于100 cfu 的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌悬液，并对所制备的菌液进行平板计数，结果见表3。

表3 菌液计数结果 CFU/mL

2.1.2 供试液制备 取样品100 cm2，撕掉贴剂的保护层，在粘贴面上覆盖无菌纱布，置100 mL 含1%聚山梨酯80 的稀释液中，振摇30 min，即得1∶10 供试液。

2.2 方法适用性试验

本品种为橡胶贴膏，根据相关标准，橡胶贴膏每10 cm2不得检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

2.2.1 铜绿假单胞菌检查方法适用性试验 供试品阳性对照试验：取供试液10 mL 按薄膜过滤法，加入稀释液100 mL，滤干，再用200 mL 稀释液冲洗（每次100 mL），在最后一次冲洗液中加入上述制备好的铜绿假单胞菌悬液。过滤后转移滤膜接种至100 mL TSB 中，经33 ℃培养18 h 后取上述培养物划线接种于CA 平板上，33 ℃培养24 h 后观察结果。

阴性对照试验：取稀释液10 mL 按薄膜过滤法，加入稀释液100 mL，滤干，再用200 mL 稀释液冲洗（每次100 mL）。过滤后转移滤膜至100 mL TSB中，经33 ℃培养24 h 后取上述培养物划线接种于CA 平板上，33℃培养72 h 后观察结果。

结果：供试品阳性对照试验中CA 平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性,经分离纯化和VITEK2compact 型自动微生物快速检测分析系统鉴定确证为铜绿假单胞菌；阳性对照试验中CA 平板上无菌落生长（未检出铜绿假单胞菌）。

样品控制菌铜绿假单胞菌检查采用上述薄膜过滤法时其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计，认为方法可行。

2.2.2 金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验 供试品阳性对照试验：取供试液10 mL 按薄膜过滤法，加入100 mL 稀释液，滤干，再用200 mL 稀释液冲洗（每次100 mL），在最后一次冲洗液中加入上述制备好的金黄色葡萄球菌悬液。过滤后转移滤膜接种至100 mL TSB 中，经33 ℃培养18 h 后划线接种于MSAM 平板上，33 ℃培养24 h 后观察结果［4-7］。

阴性对照试验：取稀释液10 mL 按薄膜过滤法，加入100 mL 稀释液，滤干，再用200 mL 稀释液冲洗（每次100 mL）。过滤后转移滤膜接种至100 mL TSB 中，经33 ℃培养24 h 后划线接种于MSAM 平板上，33 ℃培养72 h 后观察结果。

结果：供试品阳性对照试验中MSAM 平板上有黄色菌落生长，经分离纯化和VITEK2compact 型自动微生物快速检测分析系统鉴定确证为金黄色葡萄球菌；阴性对照试验中MSAM 平板上无菌落生长（未检出金黄色葡萄球菌）。

药品控制菌金黄色葡萄球菌检查采用上述薄膜过滤法时其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计，认为方法可行。

3 讨论

关节解痛膏为中药复方橡胶贴膏制剂，其处方包含三十一味中药，对细菌有一定的抑菌作用［8-12］。常规法往往不适用于控制菌检查方法的验证，需采用薄膜过滤法才可去除对细菌的抑制作用，以pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液进行冲洗，以100 mL 和300 mL 为冲洗量进行试验，最终确定300 mL 冲洗量［13-14］。

本研究最初按照《中国药典》2020 年版规定，采取“取供试品100 cm2，加入含10%无菌十四烷酸异丙酯的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，45 ℃保温振摇30 min”的方法制备1∶10 供试液,出现了水油分层不明显的情况，经过一系列的试验，最终将表面活性剂“10%无菌十四烷酸异丙酯”改为“1%聚山梨酯80”，供试品溶液能完全溶解，无油水分层的情况出现［15-18］。综上所述，最后将供试液制备方法确定为“取供试品100 cm2，撕掉贴剂的保护层，在粘贴面上覆盖无菌纱布，置100 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（含1%聚山梨酯80）中，振摇30 min，作为1∶10 供试液”［19-21］。

本研究采用《中国药典》2020 年版四部通则1106 非无菌产品微生物限度检查中控制菌检查法对关节解痛膏控制菌检查方法进行研究，采用薄膜过滤法，使用300 mL 稀释液进行冲洗，该方法可操作性强、准确性高。