生姜中姜酚类化合物的制备工艺研究

2022-10-11 06:52:24董文南柴尧郑洋滨刘剑
药品评价 2022年14期
关键词:姜辣素大孔生姜

董文南,柴尧,郑洋滨,刘剑

1.江西省药品检验检测研究院,国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室,江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心,江西 南昌 330029;2.南京丽来医药科技有限公司,江苏 南京 210023

姜为姜科多年生草本植物姜(Zingiber officinaleRosc.)的根茎,为药食两用的安全性较高的一味中药,使用历史悠久,药理作用确切,用途十分广泛。中医认为,生姜具有解表散寒、温中止呕、化痰止咳等功效[1]。《本草纲目》中记载:生姜气味温辛,外服去臭气,通神明,经五脏除风邪寒热,伤寒头痛鼻塞,咳逆上气,止咳吐,去痰下气[2]。科学研究表明生姜发挥的药效作用与姜酚的存在有关,姜酚的种类有很多,其中6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚含量较多[3-4]。临床前研究表明,这种天然物质可能作为各种形式的癌症的补充治疗手段,包括结肠癌、肺癌、肝癌和乳腺癌等[5-7],姜酚类化合物可以作为重要的先导分子,用于开发治疗药物,治疗各种危及生命的癌症[8-9]。姜酚的化学性质极不稳定,易氧化变质,易见光受热分解,且在生姜中含量较低,不易分离[10]。姜酚为脂溶性成分,不同的提取条件对姜酚的提取效率有较大影响[11]。因此,姜酚的提取分离、纯化鉴定以及其化学合成或结构改造等[12-13]工作,备受国内外科研工作者的重视。目前国内对生姜中的6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚提取方法尚未确定,系统性比较尚不全面,本试验以生姜中6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚为指标,运用溶剂提取法和树脂进行纯化,最大限度地提取出生姜中的6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚,为后期将生姜开发成各种形式的癌症补充治疗产品提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ME204TE 型电子天平;MS205DU 型电子天平;HH-6 型数显恒温水浴锅;N-1100D-WD 型旋转蒸发仪;ZQPZ-228 型低温振荡器;LC-20ADXR 型高效液相色谱。

1.2 材料

生姜(产地:南昌)购于超市,经江西省药品检验检测研究院的万林春副教授鉴定为姜科植物姜(Zingiber officinaleRosc.)的新鲜根茎。6-姜辣素对照品(Sigma 公司,批号:SLCG1228);D-101、AB-8、HPD-950、SP70、SP207、XAD7HP 大孔吸附树脂、聚酰胺树脂(江西省东方化玻设备有限公司)。正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 姜酚的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱:OSAKA SODA CAPCELL PAKC18 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0~10 min,45% A;10~15 min,45% →48% A;15~17 min,48% →60% A;17~43 min,60% A;43~45 min,60% →67% A;45~48 min,67% →69% A;48~58 min,69%→71% A);检测波长:282 nm;流速:0.5 mL/min ;柱温:25 ℃;进样量:15 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称定适量6-姜辣素对照品,加甲醇溶解,制成质量浓度为87 μg/mL 的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 投料药材含量:取生姜切成1~2 mm 的小块,取约1 g,精密称定,置100 mL圆底烧瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定重量,加热回流30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

药液含量:精密量取药液适量,置10 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.1.4 姜酚的测定方法 依据《中国药典》(2020 年版)生姜含量测定项下规定,通过检测并计算6-姜辣素含量;以6-姜辣素为对照,利用校正因子分别计算8-姜酚(校正因子:0.770 8)和10-姜酚(校正因子:0.782 3)的含量。6-姜辣素对照品和生姜样品溶液中的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图:A.6-姜辣素对照品溶液;B.生姜样品溶液

2.2 姜酚提取工艺优选

75%乙醇提取次数单因素试验结果表明回流提取2 次,6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的相对提取率均大于85%,故选择回流法提取2 次进行正交试验优选。以姜酚相对提取率为考察指标[(6-姜辣素相对提取率+8-姜酚相对提取率+10-姜酚相对提取率)/3,有效成分相对提取率=药液中含量/投料药材含量×100%],选择乙醇体积分数、加醇量及提取时间为考察因素,在单因素试验基础上,每个因素选择3 个水平。准确称取生姜20.0 g,搅碎,共9 份,选用L9(34)正交表设计试验,试验安排及直观分析结果见表1,方差分析见表2。

表1 生姜提取工艺正交试验安排及直观分析

表2 生姜提取工艺方差分析表

由直观分析可知,各因素对生姜姜酚提取工艺的影响顺序为A>B>C。方差分析结果表明因素A 具有显著性影响,其中k3>k2>k1,故选择A3,其他因素则均无显著性影响,其中因素B 中k3 ≈k2>k1,综合乙醇成本考虑,故选择B2;其中因素C 各水平差异较小,综合时间成本考虑,故选择C2;综上,最佳工艺组合A3B2C2,即分别加10倍和5 倍量75%乙醇提取2 次,每次1.0 h。称取生姜100 g,搅碎,平行3 份,按最佳工艺进行提取,结果姜酚的相对提取率分别为93.6%,91.5%,92.0%,平均值92.4%,RSD 为1.18%。表明优化后工艺合理、稳定、可行。

2.3 姜酚树脂纯化工艺优选

2.3.1 上样液制备 称取生姜500 g,搅碎,按照最佳工艺提取,减压回收乙醇至无醇味,加水稀释成每毫升0.5 g 生药的药液,备用。

2.3.2 树脂型号选择 准确称取预处理好的大孔树脂各5.0 g,分别置50 mL 锥形瓶中,各精密加入上样液20 mL,于室温振摇(120 r/min)16 h 至吸附平衡,上层液滤过,按照“2.1”进行检测。滤渣再精密加入75%乙醇100 mL,后续步骤同上,解析液按照“2.1”进行检测。计算姜酚静态收率(静态吸附率×静态解吸率),结果见表3。由表可知,XAD7HP 型大孔吸附树脂的静态收率为98.7%,明显优于其他型号树脂。

表3 不同型号树脂静态吸附洗脱 %

2.3.3 动态吸附考察 量取预处理好的XAD7HP 型大孔吸附树脂20 mL,湿法装柱,量取上样液300 mL,缓慢上样,控制流速,以2~3 BV/h 的体积流量通过树脂层,分份收集上样流出液(20 mL/份),每份按照“2.1”进行检测。以累计流出液体积为横坐标,泄漏率为纵坐标,绘制泄漏曲线,结果见图2,当上样液体积超过200 mL 时,姜酚开始泄露。因此,确定最大上样量为每5 g 生药用湿树脂1 mL。

图2 姜酚泄露曲线

2.3.4 动态解吸曲线 量取预处理好的XAD7HP 型大孔吸附树脂20 mL,湿法装柱,精密量取上样液200 mL,以2~3 BV/h 的体积流量缓慢上样,上样结束后,依次用水、40%、60%、80%乙醇溶液4 BV进行洗脱,控制洗脱流速2~3 BV/h,洗脱液分份收集(2 BV/份),每份按照“2.1”进行检测,计算姜酚洗脱收率,结果见图3。结果表明,乙醇体积分数超过60%时,姜酚开始被洗脱出来,综合经济成本,选择75%乙醇作为洗脱溶剂,水和40%乙醇作为除杂溶剂。

图3 洗脱醇浓度的考察

2.3.5 洗脱体积考察 量取预处理好的XAD7HP 型大孔吸附树脂20 mL,湿法装柱,精密量取上样液200 mL,以2~3 BV/h 的体积流量缓慢上样,上样结束后,依次用水、40%乙醇溶液4 BV 进行除杂,控制流速2~3 BV/h,除杂液弃去。再用75%乙醇8 BV 进行洗脱,分别按0~4 BV,4~6 BV,6~8 BV单独收集,结果见图4。

图4 冲洗柱体积对姜酚洗脱收率的影响

由图可见,75%乙醇达到6 BV 时,姜酚全部洗脱完毕,因此确定75%乙醇用量为6 BV。

2.4 姜酚溶剂萃取纯化工艺优选

2.4.1 萃取水相制备 称取生姜200 g,搅碎,按照确定工艺提取、纯化,将75%乙醇洗脱液,减压回收乙醇至无醇味,加水稀释至1 g/mL。

2.4.2 萃取工艺优选 分别取萃取水相各50 mL,共4份,置150 mL 萃取瓶中,分别精密加入正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷各50 mL,振摇10 min,静置60 min,分取澄清有机相,再分别精密加入对应溶剂25 mL,振摇10 min,静置60 min,分取澄清有机相,合并,减压回收溶剂至干,加水分散,冻干,按照“2.1”进行检测,计算萃取率及纯度,结果见表4。由表可知,选择乙酸乙酯作为萃取溶剂,萃取率及纯度均高于其他溶剂。

表4 萃取溶剂考察 %

2.5 工艺验证

称取生姜100 g,搅碎,平行3 份,按上述最佳工艺条件进行提取、纯化,结果姜酚的总相对转移率分别为70.2%,73.7%,71.3%,平均值为71.7%,RSD 为2.50%;纯度分别为66.3%、63.2%、65.9%,平均值为65.1%,RSD 为2.59%。表明优化后工艺合理、稳定、可行。

3 讨论

大量研究证实生姜中的姜酚具有抗肿瘤作用,且作用机制多种多样,能够为不同类型的癌症提供更广泛的预防和治疗选择[14],因此姜酚的分离纯化工作显得尤为重要。目前,生姜总姜酚的提取方式大部分仅仅还限制于溶剂提取方面,纯化方面尤其是柱层析方面的工作开展较少。本试验以总姜酚作为衡量指标,溶剂提取法与柱层析分离相结合,弥补溶剂法得率低的问题,提高总姜酚纯度,用于后期姜酚抗肿瘤体外试验[15]。进一步优化生姜总姜酚的提取工艺条件、最佳纯化工艺,再通过乙酸乙酯萃取的方法极大地提高了总姜酚的纯度。确定的提取纯化工艺经济合理稳定可行,姜酚纯度可达到65.1%。

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