酶法辅助提取生姜姜辣素及其对山茶油抗氧化作用研究

沈玉平, 刘 玉, 谢依帆, 何春兰, 张祖姣

(湖南南岭地区植物资源研究开发湖南省工程研究中心,湖南省银杏工程技术研究中心,湖南科技学院化学与生物工程学院,永州 425199)

姜(ZingiberofficinaleRoscoe),多年生姜科姜属草本植物,是我国常见的药食同源植物。生姜是姜的新鲜根茎,不仅是我国居民非常喜爱的调味品,也是重要的传统药材,具有解表散寒、温肺止咳、温中止吐、发汗、解毒等功效[1]。姜辣素是生姜的主要活性成分,它不仅是生姜辣味的呈味物质,更是生姜各种药理作用的活性功能因子[2]。姜辣素有益于抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗炎[5]、降血脂血压[6]、美白护肤[7]等,广泛应用于食品、化妆品、营养保健品和医药行业。

目前,姜辣素的主要来源是生姜提取,常用提取方法包括溶剂提取法、超声波辅助提取法、酶辅助提取法以及协同提取法[8]。但是,超声波辅助及微波辅助提取易破坏其生物活性,而酶反应条件温和,特异性强,可有效地破坏生姜细胞结构,加速姜辣素溶出,降低传质阻力,提高提取效率,并能有效保持提取物的生物活性,因而酶辅助法提取姜辣素日益受到大家的青睐[9, 10]。通过选用不同的酶,如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等水解破坏生姜细胞壁,研究者成功提高了姜辣素的提取率[8, 11-13],此外联合使用2种或以上的细胞壁水解酶,如纤维素酶与半纤维素酶[14]、葡萄糖苷酶[15]或果胶酶[16]的联合,进一步提高了姜辣素的提取率。但是,细胞壁并非姜辣素溶出的唯一障碍,生姜中淀粉质量分数高达50.79%,大量的淀粉颗粒与细胞壁中的木质纤维素紧密缠绕在一起,影响姜辣素的传质速率,进而影响姜辣素的提取效率[17, 18]。并且Agendra等[10]和Amiri等[19]发现,淀粉酶辅助处理的姜辣素提取率高于纤维素酶辅助处理时的提取率。为此,研究选用淀粉酶和纤维素酶,分别作用于淀粉颗粒和细胞壁,考察二者对姜辣素提取的协同作用,以高效提取姜辣素。

山茶油是我国特有的高品质木本植物油,其不饱和脂肪酸质量分数超过90%(油酸质量分数超过80%)。山茶油在储存过程中易氧化,不仅影响山茶油的风味和色泽,还会伴随产生一些人体有毒有害物质,严重影响山茶油的品质和安全性[20]。添加食品抗氧化剂,如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、特丁基对苯二酚(TBHQ)等,可以有效地缓解山茶油的氧化。但化学抗氧化剂具有潜在的毒副作用,植物源天然抗氧化剂绿色安全,替代化学抗氧化剂已是大势所趋,也是未来食品抗氧化剂的发展方向[21]。

生姜作为我国居民广为接受和喜爱的传统调味品,其安全性毋庸置疑。姜辣素提取物与山茶油色泽接近,以姜辣素提取物作为山茶油抗氧化剂,不仅有利于抑制山茶油氧化变质,还可以调节油脂色泽,增加油脂风味,提高山茶油品质。本实验通过单因素实验和正交实验优化酶辅助溶剂浸提法提取生姜姜辣素,并通过Schaal烘箱法研究其对山茶油的抗氧化作用,可为山茶油的储藏保质提供一种简便有效的策略。研究不仅为姜辣素对山茶油的抗氧化研究提供基础数据,还可有效促进生姜的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生姜、山茶油;6-姜酚(6-gingerol)、8-姜酚(8-gingerol)、10-姜酚(10-gingerol)、6-姜烯酚(6-shogaol)、BHT;纤维素酶(20 000 U/g)、淀粉酶(含有α-淀粉酶和糖化酶,20 000 U/g);乙腈、甲醇,色谱级;乙醇、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)等均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器设备

LC20-AT高效液相色谱仪,DX-30B超微粉碎机,RE-52AA旋转蒸发仪,DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱,5810R冷冻离心机,PHS-3C型pH计。

1.3 实验方法

1.3.1 姜辣素的提取及工艺条件优化

将生姜洗净去皮,切成厚度1 mm左右的薄片,50 ℃烘箱干燥至恒重(约36 h),粉碎过60目筛,可得干姜粉。姜辣素提取步骤:1)酶预处理:精确称取2.00 g干燥姜粉,加入到含有10～50 mg淀粉酶或纤维素酶的20 mL pH 4.5～6.5的磷酸缓冲液中,40～60 ℃恒温水浴酶解0.5～2.5 h,然后70 ℃水浴灭活25 min;2)乙醇浸提:在酶预处理样品中加入30 mL无水乙醇,60 ℃恒温浸提1.5 h后,3 000 r/min离心10 min,收集上清液备用,随后在沉淀中分别加入体积分数60%的乙醇50 mL按照操作进行2次提取,合并3次提取的上清液,抽滤收集滤液,滤液于50 ℃条件下旋转蒸发仪减压浓缩去除溶剂,即可得姜辣素提取物。

实验中,通过改变酶用量、酶配比、酶解温度、酶解pH以及酶解时间进行单因素实验优化,并在单因素实验结果的基础上进行正交实验优化,以获取最优的工艺条件,每次实验3个平行。其中,对照组为不经酶处理,直接利用乙醇提取姜辣素实验组。

1.3.2 姜辣素高效液相色谱分析条件

姜辣素是生姜中所有辣味物质的总称,其主要成分为6-姜酚,其次为8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚。姜辣素含量的测定在陈可可等[22]检测方法的基础上进行优化,通过高效液相色谱仪进行。分析条件:SPD-M20A二极管阵列检测器,Inertsil ODS-SP C18反相柱(Shimadu GL Inertsil ODS-SP 250 mm×4.6 mm, 5 μm),流动相A为超纯水,流动相B为乙腈,流速1.0 mL/min,进样体积10 μL,检测波长280 nm,柱温30 ℃。采用梯度洗脱方法分析姜辣素,洗脱程序为0～6 min,体积分数55%～65% B;6～25 min,体积分数65%～80% B;25～30 min,体积分数80%～55% B,在此条件下,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚可以较好分离(图1)。

图1 4种姜辣素标准品混合液高效液相色谱图

1.3.3 姜辣素标准曲线的制作

精密称取6-姜酚标准品10.16 mg、8-姜酚10.08 mg、10-姜酚标准品9.83 mg、6-姜烯酚标准品10.11 mg,分别用色谱级无水甲醇超声溶解,并定容至10 mL,作为标准品母液,4 ℃避光保存备用。分别吸取6-姜酚母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL的容量瓶中,以无水甲醇定容,按照1.3.2的分析方法进行分析测定,以质量浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,并进行线性回归得到标准曲线回归方程,回归方程见表1。

表1 姜辣素标准曲线线性回归方程

1.3.4 提取物姜辣素的测定

取少量姜辣素提取物,以甲醇稀释适当倍数,吸取2 mL用0.45 μm PTFE针式疏水过滤器过滤,按照1.3.2中的方法进行测定,并按照相应回归方程和提取液体积,分别计算6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度,姜辣素的总质量按照公式计算。

m0=(c6-姜酚+c8-姜酚+c10-姜酚+c6-姜烯酚)×V

式中:m0为提取物姜辣素总质量;c6-姜酚、c8-姜酚、c10-姜酚、c6-姜烯酚分别为6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的质量浓度;V为提取液体积。

经正交实验优化后的姜辣素提取物,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的质量浓度分别为86.80、32.98、13.72、12.82 mg/mL,因此总的姜辣素质量浓度为146.32 mg/mL。

1.3.5 姜辣素提取率的测定

样品姜辣素的提取率按照以下公式计算。

式中:m0为提取物姜辣素总质量;m为提取所用姜粉的总质量。

1.3.6 姜辣素提取物对山茶油的抗氧化作用

采用Schaal烘箱法研究姜辣素提取物对山茶油的抗氧化作用。按照1.3.4中测定的姜辣素质量浓度,将姜辣素提取物稀释成姜辣素质量浓度为500 μg/mL的母液,精确称取50.00 g山茶油置于广口瓶中,分别加入100、200、300、400、500、600 μL姜辣素母液,调整姜辣素含量分别为50、100、150、200、250、300 μg/50 g山茶油,充分混匀,以不添加任何抗氧化剂的山茶油为空白对照,以化学抗氧化剂BHT(300 μg/50 g山茶油)为阳性对照,置于(65±1)℃鼓风干燥箱中,每隔3 d取样测定样品的过氧化值(POV),每个处理3个平行。POV参照GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[23],采用滴定法测定。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 26.0进行显著性差异和方差分析,P<0.05定义为显著,P<0.01定义为极显著,采用Origin 9.0进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 酶用量对姜辣素提取的影响

考察淀粉酶和纤维素酶用量均为0、5、10、15、20、25、30、35 mg/g干姜粉时,对姜辣素提取率的影响,确定酶的最佳用量,结果见图2。

图2 酶用量对姜辣素提取率的影响

利用酶辅助处理可大大提高姜辣素提取率,随着淀粉酶和纤维素酶用量的增加,姜辣素提取率逐步上升,并同时在25 mg/g时达到峰值(3.85±0.07)%和(3.66±0.06)%,较对照分别提高43.13%、38.63%。因此,最佳酶用量为25 mg/g干姜粉。Nagendra等[10]和Varakumar等[15]研究发现,酶处理可大幅度提高姜辣素提取率,这与本研究结果一致。这是因为生姜的主要成分为淀粉,其次为木质纤维素和果胶,并且胞外的淀粉颗粒与细胞壁木质纤维素紧密缠绕,因而阻止胞内活性成分的溶出[17, 24]。淀粉酶、纤维素酶、蜗牛酶、蛋白酶、果胶酶等酶处理可以专一性地水解淀粉和纤维素、果胶、蛋白质等细胞壁组分,有效破坏生姜的细胞结构,促进活性物质溶出,从而提高提取效率。Nagendra等[10]分别利用α-淀粉酶、纤维素酶、复合多糖酶、蛋白酶和果胶酶预处理干姜粉,使姜辣素提取率分别较对照分别提高90.0%、58.5%、90.0%、21.8%、60.0%;Amiri等[19]使用α-淀粉酶预处理干姜粉,使姜辣素和生姜多酚提取率分别提高2.8、2.2倍,本研究使用淀粉酶和纤维素酶亦同样使姜辣素提取率分别提高43.13%和38.63%。

酶用量较低时,水解不完全,因此提取率随酶用量的增加持续上升。当达到最佳酶用量25 mg/g时,水解反应比较完全,提取率达到峰值。王琛等[14]利用纤维素酶和半纤维素酶辅助提取姜辣素时亦发现,一定范围内酶量的增加可提高姜辣素提取率,这与本研究的结果一致。当酶用量大于25 mg/g时,继续加大酶用量对姜辣素提取率无实质性影响,因为酶浓度达到一定值后,底物已经被充分饱和,继续提高酶浓度并不能提高催化效率。此外,相同酶浓度条件下,淀粉酶的提取率均高于纤维素酶,Nagendra等[10]研究证实,淀粉酶辅助处理的姜辣素提取率高于纤维素酶处理。这是由于生姜中淀粉质量分数(50.79%)显著高于纤维素(3.84%),胞外覆盖大量的淀粉颗粒,并与细胞壁中的木质纤维素紧密缠绕在一起,是姜辣素溶出的重要障碍[17, 18]。淀粉酶能有效地水解淀粉,可解除姜辣素溶出的障碍,因而导致提取率提高。

2.2 淀粉酶与纤维素酶对姜辣素提取的协同作用

鉴于淀粉酶可水解胞外覆盖的淀粉颗粒,纤维素酶可水解细胞壁的主要成分木质纤维素,因此二者联用可能更有效地破坏生姜细胞结构,降低姜辣素的传质阻力,提高姜辣素提取效率。为此,考察了不同淀粉酶和纤维素酶复合酶用量以及不同配比情况下对姜辣素提取率的影响,结果见表2。

表2 不同淀粉与纤维素酶配比及浓度对姜辣素提取率的影响

淀粉酶和纤维素酶对姜辣素的提取具有良好的协同作用,除1∶4配比外,相同的酶用量,复合酶的提取率均高于单一酶,并且1∶4配比复合酶提取率仍高于相同酶用量的单一纤维素酶提取率;而在提取率相当的情况下,复合酶用量显著减少。复合酶配比为3∶2时效果最好,15 mg/g时即达到峰值(3.95±0.07)%,稍高于单一酶处理的最大提取率,但酶用量减少40%。生姜细胞外覆盖大量的淀粉颗粒,并与细胞壁中的木质纤维素紧密缠绕在一起,与细胞壁构成了生姜胞内活性物质溶出的双重障碍。因此,多酶联合处理对生姜生物活性物质的提取往往具有良好的协同作用。例如,王琛等[14]联合使用纤维素酶和半纤维素酶,使姜辣素提取率较溶剂提取法提高了30%;Varakumar等[15]通过纤维素酶和葡萄糖苷酶辅助处理,使6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚提取效率分别提升64.10%、87.80%、62.78%、32.00%;喻书诚等[18]研究发现果胶酶和纤维素酶联合作用,对黄姜皂素的提取具有良好的协同作用,这与本研究的结果类似。因此正交实验中采用淀粉酶∶纤维素酶=3∶2的配比,15 mg/g的酶用量。

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2.3 酶解温度对姜辣素提取的影响

本研究所用淀粉酶和中性纤维素酶为真菌来源酶,在40～60 ℃温度范围内较稳定。为此,考察了40、45、50、55、60 ℃条件下酶解处理对姜辣素提取率的影响,结果见图3。

图3 酶解温度、pH和时间对姜辣素提取率的影响

随着温度的提高,姜辣素提取率持续上升,55 ℃时达到峰值,此后下降。周泊宁等[11]和徐丽萍等[25]在纤维素酶辅助超声提取姜辣素的研究中发现,温度升高有利于提高姜辣素提取率,但到达峰值后继续提高温度,将导致姜辣素提取率下降,这与本研究结果类似。这是由于温度较低时,酶解作用不彻底,随着温度的升高,酶活性增强,胞外的淀粉颗粒和细胞壁中的木质纤维素水解速度加快,对生姜细胞结构的破坏作用增强;此外,温度的升高,分子运动速度加快,传质速率亦加快,而且高温可导致细胞膜结构发生变化,因而更利于姜辣素溶出,提高提取率[26]。但是,当酶处理温度提高至60 ℃时,姜辣素提取率下降,这是因为高温条件下,酶的稳定性减弱,逐渐失活,导致水解效果削弱。此外,Bhattarai等[27]研究发现,姜辣素在水相中60 ℃即开始降解,从而导致姜辣素提取率下降。因此,正交实验的酶解温度选择55 ℃。

2.4 酶解pH对姜辣素提取的影响

本研究所用淀粉酶和中性纤维素酶分别在pH 4.0～8.0和4.5～6.5范围内较稳定,因此考察了pH 4.5、5.0、5.5、6.0和6.5环境条件下,酶解处理对姜辣素提取率的影响,结果如图3所示。

随着pH值的上升,姜辣素提取率逐步提高,酶解pH为5.5时达到峰值,随后下降,说明pH5.5时,酶水解效果最佳,最利于破坏生姜细胞结构,释放姜辣素。徐丽萍等[25]、裴小娜等[28]和李晓等[29]分别在利用纤维素酶辅助提取姜辣素、生姜挥发油和生姜精油时亦发现,在一定pH值范围内,提取率随pH的提高而上升,但是继续提高pH值时,提取率下降,可能是由于pH的升高,影响了酶蛋白侧链基团的解离,使酶蛋白的构象发生变化,降低了底物分子与酶活性中心的结合力和催化效率,从而影响姜辣素的提取率。因此,正交实验的pH值选择5.5。

2.5 酶解时间对姜辣素提取的影响

酶解时间关系到生姜细胞结构破坏是否充分,对姜辣素提取率有重要的影响。为此,考察了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h酶处理时间对姜辣素提取效率的影响。从图3可以看出,姜辣素提取率随酶解时间的增加,先上升后下降,在1.0 h时达到峰值,徐丽萍等[25]和谭索等[30]利用纤维素酶辅助提取姜辣素和姜黄素也得到了类似的结果。酶解时间过短,水解不充分,姜辣素无法充分溶出,因而提取率较低。酶解超过1 h后,继续延长酶解时间,提取率开始下降,这是因为随着酶解时间的延长,底物浓度降低,酶活力下降,并且生成的产物或占据酶催化部位,或与酶结合形成复合体,从而导致酶催化效率降低[31]。此外,长时间浸泡也会导致其他杂质一并溶出,高温下与姜辣素相互作用,因而导致姜辣素含量下降[27]。因此,正交实验选择1 h的酶解时间。

2.6 正交实验

2.6.1 正交实验优化姜辣素提取工艺条件

在单因素实验的基础上,按照淀粉酶∶纤维素酶=3∶2的比例,选择复合酶用量(A)、酶解温度(B)、酶解pH(C)和酶解时间(D)4个因素作为考察对象,优化姜辣素提取工艺条件,以提高提取率。正交因素水平设计表见表3,正交实验设计与结果见表4,方差分析见表5。

表3 正交设计表

表4 正交实验结果与统计分析

表5 正交实验方差分析

极差值的大小反映了各因素对姜辣素提取率的影响,从表4可以看出,各因素对姜辣素提取率的影响为复合酶用量(A)>酶解温度(B)>酶解pH(C)>酶解时间(D),最优组合为A2B2C2D3,即复合酶用量15 mg/g干姜粉,酶解温度为55 ℃,酶解pH为5.5,酶解时间为1.25 h。由表5的方差分析结果可知,4个因素对姜辣素的提取均极显著,其显著性为复合酶用量(A)>酶解温度(B)>酶解pH(C)>酶解时间(D),这说明4个因素均是影响酶处理效果的关键因素,对姜辣素提取率有着重要的影响。

2.6.2 最优工艺条件实验验证

按照正交实验得出的最优工艺组合A2B2C2D3,即复合酶用量为15 mg/g干姜粉,酶解温度为55 ℃,酶解pH为5.5,酶解时间为1.25 h,按照此条件处理干姜粉,以未经酶处理的样品为对照,提取姜辣素。在优化条件下,姜辣素提取率达到(4.75±0.07)%,较乙醇直接提取的姜辣素提取率(2.57±0.06)提高84.82%,说明在优化后的酶解工艺条件下,复合酶可以更好地破坏生姜细胞结构,减轻姜辣素传质阻碍,促进姜辣素溶出,从而提高姜辣素提取率。

2.7 姜辣素提取物对山茶油的抗氧化作用

2.7.1 姜辣素浓度对山茶油的抗氧化作用

取50 g/份的山茶油6份,分别添加不同体积的姜辣素提取物,使样品中的姜辣素含量分别为50、100、150、200、250、300 μg/50 g山茶油,以不添加任何抗氧化剂的山茶油为阴性对照,以300 μg/50 g山茶油的BHT为阳性对照,测定3～15 d时各样品的过氧化值,结果见图4。

注:GE,姜辣素提取物;50 μg GE每份样品(50 g山茶油)中添加含姜辣素150 μg的姜辣素提取物进行处理,以此类推。

山茶油过氧化值随时间的延长均有不同程度的上升,但姜辣素提取物实验组过氧化值显著低于空白对照,说明姜辣素提取物有对山茶油具有较好的抗氧化作用。已有研究显示,姜辣素具有良好的抗氧化特性,其抗氧化特性与姜辣素苯环上的羟基以及可以提高溶解度的侧链相关[3, 32, 33]。姜辣素提取物对山茶油的抗氧化作用随提取物姜辣素浓度的提高而增强,处理15 d,50、100、150、200、250、300μg/50 g山茶油实验组过氧化值较空白对照分别降低15.53%、26.24%、31.05%、39.28%、43.40%、46.21%。Si等[3]研究姜辣素提取物对菜籽油抗氧化作用的结果亦证实,姜辣素提取物的抗氧化作用与姜辣素浓度正相关,这与本研究的结果一致。但是,姜辣素提取物实验组的过氧化值仍显著高于BHT实验组,处理15 d,BHT实验组过氧化值仅为300 μg/50 g山茶油实验组的34.93%,说明姜辣素提取物抗氧化性能与BHT相比仍有一定差距。

2.7.2 姜辣素组分与姜辣素提取物复配对山茶油的抗氧化作用

图5结果显示,虽然姜辣素提取物对山茶油的抗氧化作用随姜辣素浓度的提高而增强,但与合成抗氧化剂BHT仍有较大差距。如若继续提高姜辣素浓度,虽可提高抗氧化效果,但亦会影响山茶油的风味、口感和色泽。为此,在保持姜辣素含量为300 μg/50 g山茶油的前提下,将姜辣素提取物分别与6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚按质量比1∶1进行复配,以不添加任何抗氧化剂的山茶油为空白对照,以300 μg/50 g山茶油的BHT为阳性对照,考察其对山茶油抗氧化作用的影响。

注:GE,姜辣素提取物;150 μg GE+150 μg 6-姜酚表示每份样品(50 g山茶油)中加有150 μg的6-姜酚标准品以及含姜辣素150 μg的姜辣素提取物,以此类推。

6-姜酚与姜辣素提取物复配组过氧化值显著高于单一姜辣素提取物处理组,说明6-姜酚对姜辣素提取物的山茶油抗氧化具有拮抗作用。但是8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚复配组过氧化值均显著低于单一姜辣素提取物处理组,与阳性对照BHT较为接近,三者无明显差异,这说明8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚均对姜辣素提取物的山茶油抗氧化具有协同增效作用,且其抗氧化效果与化学抗氧化剂BHT较为接近。生姜中含量最高的姜辣素为6-姜酚,质量分数超过60%[22]。但是,Ko等[34]研究发现,姜辣素提取物抗氧化性能与6-姜烯酚浓度正相关;Dugasani等[35]通过自由基清除实验比较了4种姜辣素的抗氧化性能,结果显示抗氧化性能6-姜烯酚>10-姜酚>8-姜酚>6-姜酚,并推测可能是6-姜烯酚的不饱和双键和10-姜酚、8-姜酚侧链长度的增加导致了抗氧化性能的提高。

3 结论

淀粉酶和纤维素酶复合酶处理对生姜姜辣素的提取具有协同增效作用,通过单因素实验和正交实验优化了酶辅助处理提取姜辣素工艺条件,得到最佳工艺条件为,复合酶中淀粉酶纤维素酶配比3∶2,酶用量15 mg/g干姜粉,酶解温度55 ℃,酶解pH为5.5,酶解时间1.25 h,在此条件下,姜辣素提取率达到(4.75±0.07)%,质量浓度为0.293 g/mL。姜辣素提取物对山茶油的具有较好的抗氧化作用,并随提取物姜辣素浓度的提高而增强,但与化学抗氧化剂BHT仍有一定差距;8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚与姜辣素提取物复配,均对山茶油抗氧化具有协同增效作用,其抗氧化效果与BHT较为接近。