土炒山药的薄层色谱鉴别及尿囊素含量测定研究

唐庆，王然，杨德泉，丁野

1.湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000；2.湖南省药品检验检测研究院，湖南 长沙 410001

山药为薯蓣科植物薯蓣的干燥根茎，是中医临床常用的健脾补气中药，也是食药两用植物。山药中含有尿囊素、熊果苷、黏液蛋白、香草醇、烟酰胺、L-色氨酸、淀粉、苯丙氨酸等成分，尿囊素是重要有效成分之一［1-2］。尿囊素具有抗溃疡、抗炎、加快伤口愈合、促进细胞生长、软化角质蛋白、保护肾细胞、保护心肌细胞等作用［3-6］。清·凌奂《本草害利》［7］载“土炒”方法，主张“入脾胃土炒”，土炒山药炮制是取净山药片用灶心土炒至表面均匀挂土粉，净山药经土炒后增强补脾止泻之功效。《中华人民共和国药典》2020 年版一部山药项下收载了山药片及麸炒山药两种饮片，该标准中，鉴别（1）为显微鉴别，鉴别（2）为薄层色谱法，未收载含量测定项目。《湖南省中药饮片炮制规范》2010 年版收载有山药、麸炒山药、土炒山药三种饮片［8］，但均未建立薄层色谱鉴别及含量测定方法。本研究为完善土炒山药饮片标准，参考有关文献［9-13］，建立了土炒山药饮片中薄层色谱鉴别和尿囊素高效液相色谱含量测定方法。

1 仪器、试药和样品

1.1 仪器

瑞士梅特勒-托利多公司AB135-S 型电子天平；北京光明DZF 型真空干燥箱 ；昆山美美公司KQ-200B 型超声仪（功率300 w，40 kHz）；日本shimdzu 公司UV-2700 紫外-可见光分光光度计；日本shimdzu 公司LC-20AT 高效液相色谱仪及SPD-M20A 检测器；美国Agilent 公司1260 infinity Ⅱ高效液相色谱仪及DAD-G7115A 检测器；湖南平凡TG16-Ⅱ型医用离心机（功率0.7 kW）。

1.2 试药和样品

山药对照药材（批号121137-201807），尿囊素对照品（批号111501-200202，含量：100%）均购自中国食品药品检定研究院。10 cm×20 cm 硅胶G 薄层板（默克公司）；美国TEDIA 公司色谱纯甲醇；中沃制水机制备的超纯化水;其他试剂均为国产分析纯。8 批土炒山药样品见表1。

表1 土炒山药饮片来源

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

分别取T1～T8 样品粉末（过2 号筛）4 g，按《中国药典》2020 年版一部山药项下薄层色谱法进行试验，结果见图1。

图1 土炒山药薄层色谱

8 批供试品薄层色谱图中显示的荧光斑点与山药对照药材显示的荧光斑点颜色与位置一致；斑点清晰分离较好。

2.2 高效液相含量测定及方法学考察

2.2.1 色谱条件 色谱柱：YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为224 nm；柱温35 ℃；流速：0.4 mL/min；流动相；甲醇-磷酸二氢钾缓冲溶液（取超纯化水约1 800 mL 加磷酸二氢钾6.8 g 搅拌使溶解，用磷酸调pH4.0，倾入2 000 mL容量瓶中，加超纯化水至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤）（1∶99）；进样量为10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取尿囊素对照品（真空干燥箱P2O5减压干燥12 h 以上）适量，加20%乙醇溶液（以下简称溶剂）制成浓度为87.480 μg/mL 尿囊素对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取过三号筛的土炒山药样品粉末约0.55 g，精密称定，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加溶剂25 mL，称重，放置在有冰袋的超声仪中超声处理30 min，放冷，震荡10 min,再称重，用溶剂补重，摇匀，倾入50 mL 具塞离心管中离心10 min（4 000 r/min），静置，上清液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.4 专属性与系统适用性试验 按上述色谱条件（下同）取20% 乙醇溶液（溶剂空白）、对照品溶液及供试品溶液进样测定，结果见图2。

图2 中空白溶剂无干扰，尿囊素对照品保留时间为8.086 min，土炒山药供试品溶液尿囊素保留时间为8.081 min，与对照品溶液中尿囊素保留时间一致，其他成分与尿囊素的分离较好，基线平稳，专属性好。尿囊素与相邻色谱峰分离度（R）分别为7.80、1.93 达到有效分离，尿囊素峰理论板数为25 065，峰形尖锐对称，理论板数、分离度等符合要求。

图2 HPLC色谱图：A.溶剂；B.尿囊素对照品溶液；C.供试品溶液

2.2.5 线性关系考察 精密称取尿囊素对照品（真空干燥箱P2O5减压干燥12 h 以上,含量以100%计）21.87 mg，加溶剂制成浓度为437.40 μg/mL 对照品贮备溶液，精密量取贮备溶液适量加20%的乙醇溶液依次稀释为含尿囊素浓度437.40、218.70、109.35、87.48、54.675、27.338、2.733 8 μg/mL 对照品溶液。分别取10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，尿囊素回归方程为y=6.768 9x+8.299 4，r=1.000 0；结果表明尿囊素在2.733 8～437.40 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一批土炒山药样品（批号2019101512）制备一份供试品溶液（按上述供试品溶液制备方法，下同），在制备后0、3、6、9、12、24 h，分别取10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测尿囊素峰面积值，RSD=0.28%。表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.2.7 精密度试验 取稳定性试验项下的供试品溶液连续进样6 次，测尿囊素峰面积值，RSD=0.54%，数据说明精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批土炒山药样品（批号2019101512）6 份，配成6 份供试品溶液分别进样测定，结果（按干燥品计算）见表2，可知方法重复性良好。

表2 重复性试验结果

2.2.9 耐用性试验 为确保方法的可靠性，测定条件小的变动测定结果不受影响，本研究采用不同高效液相色谱仪和不同品牌的色谱柱考察本方法色谱系统的耐用性。分别用设备（1）仪器LC-20AT，色谱柱ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，编号USAG019558，Agilent 公 司）；设备（2）仪器Agilent 1260 Ⅱ，色谱柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，编 号HS12S05-2546WT，YMC 公 司）按“2.2.1”色谱条件平行测定3 份土炒山药供试品溶液中尿囊素峰面积，结果见表3，试验表明本方法耐用性良好。

表3 不同设备下含量测定 %

2.2.10 加样回收率试验 取同一批号（批号2019101512，水分11.96%，含量按干燥品计算为0.302%）土炒山药样品9 份，每份约0.27 g，每份精密加入浓度为448.00 μg/mL 的尿囊素对照品贮备液适量，照“2.2.3”项下操作，配制成低、中、高浓度供试品溶液各3 份进行测定，结果见表4，数据表明加样回收率较好。

表4 尿囊素加样回收率试验结果

2.2.11 样品含量测定 取序号T1～T8 土炒山药样品8批，分别制备供试品溶液并测定尿囊素峰面积，用外标法计算尿囊素含量（按干燥品计），结果见表5。

表5 样品含量测定结果 %

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别

徐自升等［14］采用薄层色谱鉴别方法，鉴别了生山药、麸炒山药，目前尚未见有采用薄层色谱鉴别土炒山药的报道。本研究按《中国药典》2020 年版一部山药项下薄层色谱法对土炒山药进行鉴别,实验表明该方法可用于土炒山药的薄层色谱鉴别。

3.2 含量测定检测波长的选择

取尿囊素对照品适量，加溶剂制成含尿囊素浓度为29 μg/mL 溶液，用紫外分光光度计在300～200 nm 范围内扫描，结果在300～240 nm 范围内尿囊素吸收度很小且随波长的减小变化不大，在240～200 nm 范围内尿囊素吸收度随波长的减小急剧上升。文献方法多采用212 nm、224 nm 检测波长，本研究中溶剂为20%乙醇溶液，流动相为甲醇-（3.4 g/L）磷酸二氢钾缓冲溶液，考虑乙醇、甲醇末端吸收较强，截止使用波长为205 nm，212 nm 靠近205 nm，故选择224 nm 为检测波长。

3.3 含量测定色谱柱、流动相及流速的选择

尿囊素别名5-脲基乙内酰脲，属于咪唑类杂环化合物，极性很大，在反相色谱中如用常规的色谱条件（如非耐水性C18 柱、流动相中有机溶剂不低于5%、流速为0.8 mL/min）保留时间很短（约3 min ），分离度难以达到要求，且色谱系统不稳定。为了延长尿囊素保留时间达到有效分离，在本研究中降低有机相的比例和流速。流动相中有机溶剂低于5%时，一般应选用耐水性ODS 柱以达到色谱系统稳定［15］。本研究选用耐水性C18 柱比较了三种高水相流动相系统：（1）纯水作流动相；（2）甲醇-水系统，两者的比例分别为1∶99 和0.5∶99.5；（3）甲醇-磷酸二氢钾缓冲液系统，两者的比例分别为（1∶99）、（2∶98）。经比较，选用甲醇-磷酸二氢钾缓冲液（1∶99）作为流动相系统适用性较好。同时比较了0.8 mL/min、0.6 mL/min、0.4 mL/min 三种流速，随流速的降低尿囊素保留时间延长。

试验结果表明采用YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）耐水柱用于分析方法的建立，采用ZORBAX SB-Aq C18 耐水柱做耐用性试验；甲醇-（3.4 g/L）磷酸二氢钾缓冲液（1∶99）作为流动相；流速为0.4 mL/min，尿囊素保留时间可达8 min 左右，土炒山药样品中尿囊素与相邻杂质峰有良好的分离且基线稳定，系统适用性达到要求。

3.4 供试品的处理

据文献报道［11-12］，尿囊素对热不稳定，供试品制备用20%乙醇溶液超声提取30 min,提取率较高。但在功率300 w，40 kHz 的超声仪中超声30 min 产生大量热量导致供试品溶液温度上升，故本研究采用冰浴中超声30 min 以降低温度。山药中含有大量的淀粉、黏液蛋白、黏液多糖，故在进样前用离心机（4 000 r/min）离心10 min，上清液用微孔滤膜过滤，以消除杂质的干扰。

3.5 不同生产单位样品中的含量

本研究测试了A、B、C、D 四个不同公司土炒山药饮片中尿囊素的含量，结果相差较大，含量在0.157%～0.302%之间，因样品量较少无规律性可循。土炒山药中尿囊素含量差异是否受产地、采收季节、炮制工艺（如切制、炒制时间与程度、翻炒速度与频次、火候等）的影响有待进一步研究。

本研究的薄层色谱鉴别方法，可以用于土炒山药的定性鉴别；高效液相色谱法测定尿囊素含量准确，方法简单、快速、稳定，可用于土炒山药的定量质量控制。