外周血单个核细胞中hsa_circ_0005836和miR-146b表达水平在肺结核诊断中的价值分析*

徐少华，黄江华，谢晓霞，杨 涛，何晓华，徐 辉

1.四川大学华西临床医学院，四川成都 610000；2.川北医学院附属三台医院/三台县人民医院检验科，四川绵阳 621100;3.川北医学院附属三台医院/三台县人民医院传染病科，四川绵阳 621100

肺结核是由结核分枝杆菌侵入人体引发，发病率呈逐年升高趋势，目前每年约有180万人死于该病，是全球严重的公共卫生问题之一[1]。我国肺结核患者人数居全球第三位，由于肺结核的耐药性与传染性，我国肺结核疫情仍很严重，因此，对肺结核进行早期诊断并准确评估肺结核患者病情，对其进行及时有效的治疗具有重要临床意义[2]。环状RNA(circRNA)是一种新型的非编码RNA分子，广泛表达于真核细胞中，因其具有结构稳定性、组织特异性，成为多种疾病诊断的理想生物标志物[3]。研究显示，肺结核患者外周血单个核细胞(PBMCs)中circRNF10表达水平升高，有望作为肺结核诊断和疗效监测的潜在生物标志物[4]。hsa_circ_0005836属于circRNA的一种，其在肺结核患者PBMCs中的表达情况少有研究。微小RNA(miRNA)可调节炎性反应、免疫反应等，可参与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺结核等多种肺部疾病的发病过程[5]，微小RNA-146b(miR-146b)为miRNA的一种，研究表明，miR-146b在甲状腺乳头状癌患者外周血中表达显著上调，与肿瘤的进展和患者预后不良有关[6]。miR-146b在肺结核患者PBMCs中表达的相关性尚不清楚。本研究旨在通过检测肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836与miR-146b的表达情况，探讨二者的相关性及其与肺结核的关系，为肺结核患者的早期诊断提供有效依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年7月至2021年6月川北医学院附属三台医院收治的肺结核患者85例作为肺结核组，其中男53例，女32例；年龄21～58岁，平均(41.20±11.50)岁。纳入标准：(1)符合肺结核的诊断标准[7]；(2)首次确诊为肺结核且未经任何治疗；(3)肝、肾功能基本正常；(4)半年内未使用抗菌药物及糖皮质激素者；(5)患者临床资料完整。排除标准：(1)合并恶性肿瘤或支气管扩张等其他呼吸系统疾病患者；(2)合并心、肝、肾功能不全者；(3)各种因素导致的自身免疫力低下或近期服用免疫抑制剂者；(4)患有严重精神疾病及语言障碍者。根据影像学肺部病灶显示，<2个病灶患者48例，≥2个病灶患者37例；根据胸部CT显示，肺部有空洞患者46例，肺部无空洞患者39例。选择同期在医院体检的健康人员(无肺结核接触史且肺部影像检查正常)90例作为对照组，其中男50例，女40例；年龄26～65岁，平均(45.56±14.70)岁。肺结核组与对照组男女比例、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经川北医学院附属三台医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较[n/n或或n(%)]

1.2试剂与仪器 逆转录试剂盒(批号IS59176，德国QIASGEN公司)；RNA提取试剂(Trizol，批号135402，美国Invitrogen公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(批号IA-10771，北京冬璞泰和科技有限责任公司)；超低温冰箱(型号DW86L388A，上海坤科仪器设备有限公司)；实时荧光定量PCR仪(型号Gentier96E，西安天隆科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1PBMCs分离及保存 肺结核组与对照组分别在抗结核治疗前、体检时采集清晨空腹静脉血(3～5 mL)于EDTA抗凝管保存，使用Ficoll淋巴细胞分离液离心分离PBMCs，于-70 ℃冰箱保存备用。

1.3.2实时荧光定量PCR法检测hsa_circ_0005836和miR-146b表达 采用实时荧光定量PCR法检测PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b相对表达量。Trizol试剂提取总RNA，检测浓度与纯度后，逆转录合成cDNA，再进行PCR反应，反应条件：55 ℃预热150 s；95 ℃预变性60 s；95 ℃变性15 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38个循环。采用2-ΔΔCt法计算hsa_circ_0005836和miR-146b相对表达量。hsa_circ_0005836(内参为GAPDH)和miR-146b(内参为U6)等引物由上海源叶生物科技有限公司合成。引物序列如下：hsa_circ_0005836上游引物为5′-ACTCATCCTTGAACCTTGC-3′，hsa_circ_0005836下游引物为5′-GGCATCTATGTACTTCAGGAC-3′；miR-146b上游引物为5′-GAGAACTGAATTCCATAGG-3′，miR-146b下游引物为5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH上游引物为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，GAPDH下游引物为5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6上游引物为5′-GCTTCGGCACATATACTAAAT-3′，U6下游引物为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 结 果

2.1对照组和肺结核组PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表达水平比较 肺结核组PBMCs中hsa_circ_0005836表达水平显著低于对照组(P<0.05)，miR-146b表达水平显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 对照组和肺结核组PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表达水平比较

2.2肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表达水平与临床病理特征的关系 不同年龄、性别的肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与肺部病灶<2个的肺结核患者比较，肺部病灶≥2个的肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表达水平显著降低，miR-146b表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与肺部无空洞的肺结核患者比较，肺部有空洞的肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表达水平显著降低，miR-146b表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表达与临床病理特征的关系

2.3肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836与miR-146b表达水平的相关性 相关性分析显示，肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836与miR-146b表达水平呈负相关(r=-0.692，P<0.05)。见图1。

图1 肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836与miR-146b表达水平的相关性

2.4ROC曲线分析hsa_circ_0005836与miR-146b对肺结核的诊断价值 hsa_circ_0005836诊断肺结核的曲线下面积(AUC)为0.868，灵敏度为87.06%，特异度为81.54%，截断值为0.77；miR-146b诊断肺结核的AUC为0.839，灵敏度为83.53%，特异度为76.38%，截断值为1.32；hsa_circ_0005836和miR-146b二者联合诊断肺结核的AUC为0.896，灵敏度为88.35%，特异度为75.00%。见图2。

图2 hsa_circ_0005836与miR-146b诊断肺结核的ROC曲线

3 讨 论

circRNA是一类单链闭合RNA分子，不受RNA外切酶影响，在真核生物中具有高度稳定性、丰富性和进化保守性。研究显示，circRNA具有miRNA和“蛋白质海绵”的作用，在调节转录和剪接方面发挥着重要作用，与肿瘤等多种疾病的发生、发展过程密切相关[8-9]。CHENG等[10]研究表明，circRNA-012091调控的PPP1R13B通过内质网应激和自噬促进肺成纤维细胞的增殖和迁移，在矽肺肺纤维化的发展中起关键作用。circRNA在组织和外周血中均有表达，且具有良好的稳定性与特异性，可作为恶性肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病、炎症性疾病等多种疾病的诊断标志物[11-13]。多项研究显示，多种circRNA在肺结核患者外周血中有表达，对肺结核的诊断具有一定价值[14-15]。黄自坤等[14]研究表明，肺结核患者血浆hsa_circ_0009024表达水平显著升高，且与患者病情相关，可作为肺结核诊断和疗效监测的潜在标志物。hsa_circ_0005836为circRNA的一种，ZHUANG等[15]通过高通量测序活动性肺结核患者PBMCs中circRNA的表达，发现hsa_circ_0005836表达显著下调，提示hsa_circ_0005836可能成为肺结核的新型潜在生物标志物。本研究结果显示，肺结核组患者PBMCs中hsa_circ_0005836表达水平显著低于对照组人员，且肺部病灶≥2个的肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表达水平显著低于肺部病灶<2个的肺结核患者，肺部有空洞的肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表达水平显著低于肺部无空洞的肺结核患者，提示hsa_circ_0005836可能与肺结核的发生、发展有关，可反映患者病情严重程度。

miRNA可参与细胞增殖、凋亡、代谢等多个生理和病理过程，与非小细胞肺癌、急性肺损伤、肺结核等肺部疾病的发生、发展密切相关，调控结核分枝杆菌感染后的免疫反应、炎症因子释放等过程[16-17]。miR-146b为miRNA的一种，是炎性反应调节因子，在先天免疫中具有重要作用，与多种疾病密切相关。研究显示，急性ST段抬高型心肌梗死患者血浆中miR-146b表达水平升高，与肌酸激酶同工酶、心肌肌钙蛋白I及冠脉造影评分呈正相关[18]。miR-146b的异常表达与肺部疾病的发生有关，ZHANG等[19]研究显示，miR-146b可通过抑制髓样分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信号通路减轻小儿肺炎的炎症损伤。在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤的小鼠模型中，过表达的miR-146b可显著减少LPS诱导的肺损伤、肺部炎症、总细胞和中性粒细胞计数、促炎细胞因子和支气管肺泡灌洗液中的趋化因子水平[20]。本研究结果显示，肺结核组患者PBMCs中miR-146b表达水平显著高于对照组人员，且肺部病灶≥2个和肺部有空洞的肺结核患者PBMCs中miR-146b表达水平较高，表明miR-146b可能成为评价肺结核患者病情的一项指标。

本研究还发现，肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836与miR-146b表达水平呈负相关(r=-0.692,P<0.05)，表明二者可能存在负向调控关系。因此，本研究推测hsa_circ_0005836通过靶向调控miR-146b的表达参与肺结核疾病的发生与发展，但具体作用机制有待结合基础研究进一步证实。本研究通过进一步分析发现，hsa_circ_0005836、miR-146b联合诊断肺结核的AUC为0.896，灵敏度为88.35%，特异度为75.00%，表明hsa_circ_0005836、miR-146b联合检测对肺结核具有一定诊断价值。

综上所述，肺结核患者PBMCs中hsa_circ_0005836呈低表达，miR-146b呈高表达，二者呈负相关，均与患者病情有关，可能作为肺结核诊断的标志物，但是其具体作用机制及临床实用价值仍需结合种族特异性、人群易感性、社会经济状况等因素做进一步系统研究。