干漆乙醇提取物通过调控HOXA-AS3/miR-29b分子轴抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭诱导凋亡*

董秋月,吴立春，刘妍乔，何进伟△

1.四川省乐山市市中区肿瘤医院检验科，四川乐山 614000；2.四川省肿瘤医院检验科，四川成都 610041

2020年全球女性乳腺癌新发病例2 260 000例，死亡病例680 000例，已超越肺癌成为全球第一大癌症[1-2]。乳腺癌病例发现时多数已经是中晚期，且复发率高、五年生存期短，给患者及其家庭带来巨大的经济压力和精神负担[3-4]。因此，寻找高效、低毒的抗乳腺癌药物是当前亟待解决的重大课题。

干漆是我国传统中药之一。近年研究显示，干漆乙醇提取物可抑制乳腺癌实体肿瘤生长及其相关的肺转移[5]，但其抗肿瘤机制目前尚未完全阐明。微小RNA(miR)-29b是一种抑癌基因，与肝癌、胆管癌、结直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生、发展密切相关[6-9]；同时miR-29b在乳腺癌中表达下调，高表达miR-29b能抑制乳腺癌增殖，诱导凋亡等生物学进程[10]。生物信息学分析显示长链非编码RNA(lncRNA)同源盒基因A反义转录3(HOXA-AS3)和miR-29b之间存在相互作用。HOXA-AS3高表达能促进肺癌[11]、胶质瘤[12]的进展，但干漆乙醇提取物能否调控HOXA-AS3/miR-29b分子轴进而影响乳腺癌细胞的生物学行为尚不清楚。本研究拟通过观察不同水平的干漆乙醇提取物对乳腺癌细胞T47D增殖、迁移、侵袭、凋亡以及HOXA-AS3和miR-29b表达的影响，初步探讨干漆乙醇提取物调控乳腺癌生物学行为的分子机制，为干漆乙醇提取物防治乳腺癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人乳腺癌细胞T47D购于美国模式培养物集存库；DMEM培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司；干漆购于中药材批发市场；细胞转染试剂LipofectamineTM 2000、TRIzol试剂盒购于美国Ivitrogen公司；微小RNA(miRNA)抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、miR-29b抑制物(anti-miR-29b)、空载体(pcDNA)、HOXA-AS3过表达载体(pcDNA-HOXA-AS3)、HOXA-AS3小干扰RNA(si-HOXA-AS3)、HOXA-AS3小干扰RNA阴性对照(si-NC)由上海生工生物工程有限公司提供；miR cDNA第一链合成试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒购于大连Takara公司；Transwell小室和基质胶购于美国BD公司；CCK-8试剂盒、膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡检测试剂盒购于杭州贝博生物技术公司；兔源P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购于美国CST公司；山羊抗兔二抗购于南京金斯瑞生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1干漆乙醇提取物的制备[13]将100 g干燥的干漆粉碎为粗粉，置于容器内，以料液比1∶3比例加入95%乙醇冷浸72 h，用纱布过滤，得滤液。重复冷浸提取3次，合并滤液，在40 ℃下减压浓缩并收回乙醇至无醇味，冷冻干燥，得干漆乙醇提取物，-20 ℃保存备用。提取率为10.5%。

1.2.2细胞培养和分组 乳腺癌细胞T47D采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。采用不同水平(0、25、50、75 μg/mL)的干漆乙醇提取物处理T47D细胞48 h，检测细胞增殖抑制率、克隆形成、迁移、侵袭、凋亡以及HOXA-AS3和miR-29b表达的变化，确定后续实验干漆乙醇提取物使用水平。为验证干漆乙醇提取物是通过调控HOXA-AS3/miR-29b分子轴进而影响乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭，利用LipofectamineTM 2000将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS3、anti-miR-NC、anti-miR-29b分别转染T47D细胞，转染成功的T47D细胞用75 μg/mL的干漆乙醇提取物干预48 h，依次记为干漆75 μg/mL+pcDNA3.1组、干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3组、75 μg/mL+anti-miR-NC组、干漆75 μg/mL+anti-miR-29b组，检测T47D细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡变化。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力 将1×104个T47D细胞铺于96孔板，根据实验分组进行相应细胞处理后，向各孔内加入10 μL的CCK-8试剂，继续孵育2 h，酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.4克隆形成实验检测细胞克隆能力 细胞按照上述分组进行干预后，用胰酶消化细胞，取2×103个细胞接种于6孔板，将细胞均匀分散后，置于细胞培养箱常规培养7 d，当看到肉眼可见的集落时，弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，分别加入多聚甲醛和结晶紫染液进行固定和染色，PBS冲洗3次，常温晾干后，显微镜下统计>50个细胞的集落数。

1.2.5流式细胞术检测凋亡 收集上述各组细胞，PBS洗涤细胞2次，离心后加入适量结合缓冲液调整为1×106cells/mL的单细胞悬液。取100 μL细胞悬液加入到流式管，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒分别加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液混匀，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.2.6Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力 侵袭实验：在小室内铺上用PBS 1∶8稀释的Matrigel(50 mg/L)基质胶备用。收集上述各组细胞，采用不含血清的培养基调整细胞水平为3×106cells/mL。将Transwell小室放入24孔板，向上室内加入300 μL的细胞悬液，下室加入含20%血清的细胞培养液，培养箱孵育24 h，小心擦去未过膜细胞，4%的多聚甲醛固定10 min，0.1%的结晶紫染色5 min，PBS洗涤后，将Transwell小室倒置于显微镜下拍照，随机选取3个视野拍照，记录过膜细胞数，其平均值即为细胞侵袭数目。迁移实验采用未包被基质胶的Transwell小室，其他步骤同上。

1.2.7qRT-PCR检测HOXA-AS3和miR-29b的表达 TRIzol试剂盒提取各组的细胞总RNA，并分别应用miR cDNA第一链合成试剂盒和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA模板，采用SYBR®Premix Ex TaqTM进行qRT-PCR检测。分别以U6和GAPDH为内参照检测miR-29b和HOXA-AS3的表达。应用2-ΔΔCt法计算miR-29b和靶标HOXA-AS3的表达量。引物由北京华大基因公司合成，序列如下。HOXA-AS3上游5′-GCTGAATTAACGGTGGCTCC-3′，HOXA-AS3下游5′-ATGGCGAGCGAAGGGAAG-3′；GAPDH上游5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′，GAPDH下游5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′；miR-29b上游5′-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3′；miR-29b下游5′-CACUGAUUUCAAAUGGUGUUAUU-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游5′-AACGCTTCTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.8Western blot检测P21、Caspase-3、E-cadherin和MMP-2蛋白的表达 各组细胞进行相应处理后弃去细胞培养液，加入4 ℃预冷的细胞裂解液，冰上裂解30 min后提取细胞总蛋白。BCA试剂盒测定细胞蛋白水平。煮沸3 min变性细胞蛋白。配制分离胶和浓缩胶，每孔上样30 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别加入稀释的P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2和GAPDH抗体后，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入稀释的二抗溶液，室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，用增强型化学发光试剂盒显色。以GAPDH为内参，采用图像处理软件ImageJ分析目的条带灰度值。

1.2.9双荧光素酶报告基因实验 采用Targetscan数据库进行靶基因预测显示，HOXA-AS3与miR-29b之间存在部分连续结合的核苷酸序列，并采用双荧光酶报告基因实验验证miR-29b和HOXA-AS3的靶向关系。含有miR-29b结合位点的野生型荧光素酶报告基因载体WT-HOXA-AS3和突变型荧光素酶报告基因载体MUT-HOXA-AS3的构建由上海吉凯基因提供。将WT-HOXA-AS3、MUT-HOXA-AS3分别与miR-con、miR-29b mimics共转染至T47D细胞，转染48 h，检测各组细胞的荧光素酶活性。为进一步验证HOXA-AS3对miR-29b的调控关系，将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS3、si-NC、si-HOXA-AS3分别转染至T47D细胞，转染48 h，采用qRT-PCR检测miR-29b的表达。

2 结 果

2.1干漆乙醇提取物对细胞T47D增殖、凋亡的影响 与空白对照组比较，干漆乙醇提取物处理组T47D细胞P21和Caspase-3蛋白的表达显著升高，细胞抑制率显著升高，克隆形成数显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

注：A为干漆乙醇提取物对细胞T47D凋亡的影响；B为干漆乙醇提取物对细胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表达的影响；a为0 μg/mL干漆乙醇提取物组，b为25 μg/mL干漆乙醇提取物组，c为50 μg/mL干漆乙醇提取物组，d为75 μg/mL干漆乙醇提取物组。

表1 干漆乙醇提取物对细胞T47D增殖、凋亡的影响

2.2干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭的影响 与空白对照组比较，干漆乙醇提取物处理组T47D细胞E-cadherin蛋白的表达显著升高，MMP-2蛋白的表达显著降低，迁移和侵袭细胞数目显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。随着干漆乙醇提取物水平的逐渐增加，其对T47D细胞迁移、侵袭的抑制作用逐渐增强。见图2、表2。

注：A为干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭能力的影响；B为干漆乙醇提取物对细胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响；a为0 μg/mL干漆乙醇提取物组，b为25 μg/mL干漆乙醇提取物组，c为50 μg/mL干漆乙醇提取物组，d为75 μg/mL干漆乙醇提取物组。

表2 干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭的影响

2.3干漆乙醇提取物对细胞T47D中HOXA-AS3、miR-29b表达的影响 与空白对照组比较，干漆乙醇提取物处理组T47D细胞HOXA-AS3的表达显著降低(P<0.05)，miR-29b的表达显著升高(P<0.05)。随着干漆乙醇提取物水平的逐渐升高，其对T47D细胞中HOXA-AS3和miR-29b表达的影响逐渐增强。见表3。

表3 干漆乙醇提取物对细胞T47D中HOXA-AS3、miR-29b表达的影响

2.4过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D增殖、凋亡的影响 与干漆75 μg/mL+pcDNA3.1组比较，干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3组T47D细胞P21和Caspase-3蛋白的表达显著降低，细胞抑制率显著降低，克隆形成数显著增多，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

表4 过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D增殖、凋亡的影响

注：A为过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D凋亡的影响；B为过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表达的影响；a为干漆75 μg/mL+pcDNA3.1组，b为干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3组。

2.5过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭的影响 与干漆75 μg/mL+pcDNA3.1组比较，干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3组T47D细胞HOXA-AS3的表达显著升高，E-cadherin蛋白的表达显著降低，MMP-2蛋白的表达显著升高，迁移和侵袭细胞数目显著增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4、表5。

注：A为过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭能力的影响；B为过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响；a为干漆75 μg/mL+pcDNA3.1组，b为干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3组。

表5 过表达HOXA-AS3能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭的影响

2.6抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D增殖、凋亡的影响 与干漆75 μg/mL+anti-miR-NC组比较，干漆75 μg/mL+anti-miR-29b组T47D细胞P21和Caspase-3蛋白的表达显著降低，细胞抑制率显著降低，克隆形成数显著增多，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5、表6。

表6 抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D增殖、凋亡的影响

注：A为抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D凋亡的影响；B为抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表达的影响；a为干漆75 μg/mL+anti-miR-NC组，b为干漆75 μg/mL+anti-miR-29b组。

2.7抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭的影响 与干漆75 μg/mL+anti-miR-NC组比较，干漆75 μg/mL+anti-miR-29b组T47D细胞miR-29b的表达显著降低，E-cadherin蛋白的表达显著降低，MMP-2蛋白的表达显著升高，迁移和侵袭细胞数目显著增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图6、表7。

注：A为抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭能力的影响；B为抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响；a为干漆75 μg/mL+anti-miR-NC组，b为干漆75 μg/mL+anti-miR-29b组。

表7 抑制miR-29b能逆转干漆乙醇提取物对细胞T47D迁移、侵袭的影响

2.8HOXA-AS3靶向调控miR-29b Starbase预测显示HOXA-AS3与miR-29b之间存在本分连续结合位点，见图7。双荧光素酶报告实验显示，与miR-NC和WT-HOXA-AS3共转染组比较，miR-29b和WT-HOXA-AS3共转染组T47D细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与miR-NC和MUT-HOXA-AS3共转染组比较，miR-29b和MUT-HOXA-AS3共转染组T47D细胞的荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表8。qRT-PCR检测显示，与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-HOXA-AS3组T47D细胞miR-29b的表达显著降低(P<0.05)；与si-NC组比较，si-HOXA-AS3组T47D细胞miR-29b的表达显著升高(P<0.05)，见表9。提示HOXA-AS3靶向miR-29b并负性调控其表达。

图7 HOXA-AS3靶向miR-29b

表8 双荧光素酶报告实验

表9 HOXA-AS3调控miR-29b的表达

3 讨 论

近年来乳腺癌的发病率和病死率不断升高并呈现年轻化趋势，虽然治疗手段及其方案不断完善，但临床治疗效果并不显著。研究显示，中药辅助治疗在提高乳腺癌患者5年生存率和延长生存期方面发挥重要作用[14]。

干漆又名漆渣、漆底、漆脚、续命筒、黑漆，历版《中国药典》均有收录，具有破瘀血、消积、杀虫等功效，主要用于治疗妇女经闭、瘀血、虫积、肝脏疾病、胃病和传染病等[15]。现代生物医学研究表明，干漆乙醇提取物具有显著的抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤和神经保护作用[16-18]。研究证实，干漆乙醇提取物可抑制人肺癌细胞A549以及人慢性粒细胞白血病K562细胞的生长并诱导凋亡作用[19-20]，抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭[21]；与此同时，干漆乙醇提取物还可通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p53途径分别调节乳腺癌细胞的存活和凋亡[22-23]。本研究结果显示，干漆乙醇提取物呈剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞T47D增殖，抑制MMP-2表达，促进P21、Caspase-3和E-cadherin表达，抑制其迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞的恶性生物学行为。

miRNA广泛参与肿瘤进展的多个生物学过程，近年来其被认为是中药化合物抗肿瘤的潜在靶点[24]。miR-29b是miR-29家族成员之一，研究显示乳腺癌等多种癌症中miR-29b异常表达，与癌细胞增殖、分化、凋亡、转移和药物耐受相关[25]。本研究结果显示，干漆乙醇提取物呈剂量依赖性地促进T47D细胞miR-29表达，抑制miR-29表达可逆转干漆乙醇提取物对T47D细胞的凋亡诱导以及增殖、迁移、侵袭抑制的影响，提示miR-29b可能是干漆乙醇提取物抗乳腺癌的作用靶点。HOXA-AS3是一种新型的lncRNA，已有研究表明肝癌中HOXA-AS3表达上调，下调HOXA-AS3表达通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MEK/ERK)信号通路进而抑制肝癌细胞增殖、转移和上皮间质转化(EMT)进程[26]。下调HOXA-AS3表达还可增强顺铂对非小细胞肺癌的体内外疗效[27]。本研究结果显示，干漆乙醇提取物呈剂量依赖性地抑制T47D细胞HOXA-AS3表达；本研究还发现，过表达HOXA-AS3可逆转干漆乙醇提取物对T47D细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响。此外，双荧光素酶报告基因实验和Western blot证实，HOXA-AS3靶向miR-29b并负性调控miR-29b表达。因此，调控HOXA-AS3/miR-29b分子轴是干漆乙醇提取物调控乳腺癌细胞恶性生物学行为的重要机制。有研究报道，漆酚可能是干漆乙醇提取物的主要化学成分[28-29]，但漆酚是否是其发挥抗癌作用的主要成分还有待后续试验进行深层次研究。