抗菌肽MPX对肠出血性大肠杆菌的体外抑菌作用及其作用机制的初步研究

黄俊杰，赵雪芹,，赵娅娅，刘双双，朱春玲，夏小静，张守平，罗维玉，徐彦召，杭柏林，孙亚伟，Hanna Fotina，胡建和*，王 磊*

（1.河南科技学院动物科技学院，河南 新乡 453003；2.Faculty of Veterinary Medicine,Sumy National Agrarian University,Sumy 40021）

近年来由于抗生素滥用，导致大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）耐药性增加，尤其对四环素类、磺胺类和青霉素类常用抗生素耐药性较强[1]。Fayemi等人从180 份新鲜牛肉和肉制品样品中的61 份检出了72种不同血清型的大肠杆菌，其中17份含产志贺毒素大肠杆菌（Shigella toxin-producingEscherichia coli，STEC）的样品中的23.6%为多重耐药性的STEC[2]。大肠杆菌耐药菌株的大量出现对人畜健康造成严重威胁，因此，研究可以治疗大肠杆菌感染的替代抗菌药显得尤为重要。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）与传统抗生素相比，具有分子量小、水溶性好、热稳定性强、抗菌机制独特、不易使细菌产生耐药性等特点[3]。抗菌肽MPX（Mastoparan-X）属于蜂毒抗菌肽家族，由14 个氨基酸组成，携带4 个正电荷，具有多种生理功能，如肥大细胞脱颗粒、钙调蛋白结合、G-蛋白激活、刺激磷脂酶A2、阳离子平面双层膜渗透；改变MPX 侧链的疏水性，可达到其对细胞膜最佳的膜亲和力和杀菌效果[4]。前期研究结果显示，MPX 对猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）具有较好的抑菌活性[5]，然而，MPX 对大肠杆菌是否也具有较好抗菌活性，尚属未知。

基于此，本实验研究了MPX 体外对肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）的抑菌活性，初步探究MPX 对EHEC 抑菌作用的机制，为该抗菌肽的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料抗菌肽MPX（H-INWKGIAAMAKKLL-NH2）、抗菌肽PR39 由上海吉尔生化有限公司合成，经反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定，其纯度＞98%。EHEC ATCC43889 为本实验室分离自溶血病人的粪便。恩诺沙星、庆大霉素、BCA 蛋白试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；PBS、LB 培养基、结晶紫、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和96 孔培养板等均购自新乡智宝生物科技有限公司；SYTO 9、碘化丙啶（PI）购自BD science 公司；苯基萘胺（N-phenyl-naphthylamine，NPN）、3, 3-二丙基硫代二碳氰碘化物[3, 3-Dipropyl thiodicarbon cyanide iodide，DiSC3(5)]购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 MPX 体外杀菌活性的检测

1.2.1 琼脂扩散法检测MPX 抑菌活性 取过夜培养的EHEC 与高压灭菌后的LB 琼脂培养基（50 ℃左右）混匀，凝固后在培养基上打孔，将10 μL 1 mg/mL 的MPX 加入孔内。分别以孔中加入10 μL 1 mg/mL 的抗菌肽PR39 为阳性肽对照，加入10 μL 1 mg/mL 的恩诺沙星（Enrofioxacin，Enro）为阳性对照，以孔中加入ddH2O 为阴性对照，37 ℃培养后测量抑菌圈直径。

1.2.2 最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MⅠC）测定 用培养基将初始浓度为1 mg/mL 的MPX 2倍倍比稀释后，再分别加入等体积2×105cfu/mL的菌液，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照；试验重复3 次，37 ℃培养12 h～16 h 后观察结果。最后一孔透明菌液对应的MPX 浓度即为MPX 对EHEC 的MIC。

1.2.3 杀菌曲线的测定 添加MPX 到OD600nm值为1.0的EHEC 菌液中，使其终浓度分别为1 MIC、4 MIC，分别于菌液中加入终浓度为50 μg/mL 的PR39 和Enro为阳性对照，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照，37 ℃培养。每隔1 h 测一次菌液OD600nm值，绘制菌液OD600nm值变化曲线；每隔1 h 将各组菌液10 倍倍比稀释后涂布于LB 平板，过夜培养后统计菌落数，并绘制MPX 作用后活菌浓度变化曲线。

1.2.4 扫描电镜观察 将无菌玻片放入6 孔板中，按1：100 的比例加入浓度为1×108cfu/mL 菌液与培养基，再加入终浓度为1 MIC 的MPX，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照。作用2 h 后PBS 洗3 次。每孔加入300 μL 2.5%戊二醛溶液。固定30 min，PBS 洗3次。30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇脱水，每次间隔15 min。离子喷金镀膜，置扫描电镜观察。

1.3 MPX 对酸、碱、温度和阳离子的稳定性检测用1 mol/L HCl 和5 mol/L NaOH 分别配制pH 值为3～11的ddH2O，并将不同pH值的ddH2O溶解MPX；将MPX溶于ddH2O 后分别在20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴锅中孵育1 h；分别用浓度为50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L 的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2溶液溶解MPX。将上述处理过的10 μL浓度为1 mg/mL 的MPX 加入到含EHEC 的LB 固体平板的孔内，通过测量抑菌圈直径来检测MPX 对酸、碱、温度和阳离子的稳定性。

1.4 MPX 对EHEC 膜通透性影响的检测

1.4.1 BCA 法检测MPX 对EHEC 细胞膜通透性的影响 将OD600nm值为1.0 的EHEC 菌液用PBS 重悬。将MPX 分别以0.5 MIC、1 MIC、2 MIC 的终浓度加入菌液中，设菌液中加入终浓度为31.25 μg/mL 的庆大霉素（Gentamicin，Gen）为阳性对照，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照，作用2 h 后离心取上清，利用BCA 蛋白含量测定试剂盒检测上清中的蛋白含量；利用酶标仪测定OD562nm值，根据标准曲线计算不同处理组菌液上清中的蛋白质含量。上清中的蛋白含量越多则表明菌体细胞膜通透性越高。

1.4.2 SYTO 9/PⅠ染色检测MPX 对EHEC 细胞膜通透性的影响 将EHEC 菌液加入放有无菌玻片的6 孔细胞板中，500 μL/孔；再分别加入终浓度为0.5 MIC、1 MIC、2 MIC MPX，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照；37 ℃孵育24 h 后，PBS 洗涤3 次；每孔加入3 μL（1：1混合的SYTO 9/PI），避光孵育15 min，使用激光共聚焦显微镜观察。细胞膜完整的细菌会发出绿色荧光，细胞膜被破坏的细菌则发出红色荧光。

1.4.3 NPN 探针检测MPX 对EHEC 外膜通透性的影响 NPN 是一种中性疏水荧光探针，通常被细菌外膜（革兰氏阴性细菌的外膜由脂多糖、磷脂、外膜蛋白和脂蛋白等成分组成，是细菌抵御外界有害物质的首要物理屏障，与细菌致病性和耐药性密切相关）排斥，当NPN 探针进入细菌外膜后荧光强度会增加。将培养至对数期的EHEC 铺于96 孔板中，加入终浓度为10 μmol/L 的NPN 溶液；20 min 后分别加入终浓度为1 MIC、2 MIC、4 MIC 的MPX，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照，在激发波长EX=350 nm、发射波长EM=420 nm 的条件下，使用酶标仪持续监测荧光强度10 min。荧光信号越强说明细菌外膜破坏得越严重。

1.4.4 PⅠ染料检测MPX 对EHEC 细胞质膜通透性的影响 加入MPX至OD600nm值为1.0的EHEC菌液中，使其终浓度分别为1 MIC、2 MIC、4 MIC，以菌液中加入ddH2O为阴性对照。37 ℃、180 r/min摇床培养10 min，离心后重悬于PBS 中。加入终浓度为30 μmol/L 的PI染料，避光孵育10 min。使用酶标仪在激发波长为535 nm、发射波长为617 nm 的条件下持续监测PI 荧光强度10 min。只有在细胞膜的完整性遭到破坏后，PI 染料才能进入细胞与细菌DNA 结合并发出红色荧光。

1.4.5 DiSC3(5)探针检测MPX 对EHEC 膜电位的影响 DiSC3(5)是一种细胞膜电位敏感性荧光探针，细胞膜电位正常时，DiSC3(5)在细胞内富集并发生荧光自淬灭，当膜电位去极化时细胞膜荧光强度增加[6]。将培养至对数期的EHEC 铺于96 孔板中，每孔加入终浓度为2 μmol/L 的DiSC3(5)溶液，避光孵育20 min；分别加入终浓度为1 MIC、2 MIC、4 MIC 的MPX，以菌液中加入ddH2O为阴性对照。使用酶标仪在622 nm激发波长和670 nm 发射波长下持续监测荧光强度10 min，通过荧光强度的变化判断MPX 对EHEC细胞膜电位的影响。上述试验均每组作3个重复。

1.5 MPX 对EHEC 生物被膜（BF）形成影响的检测

1.5.1 结晶紫染色法观察EHEC BF的形成 按照参考文献[7]的方法，将EHEC铺于96孔板中，并加入不同终浓度的MPX（0.5 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）；以菌液中加入ddH2O 作为阴性对照，37 ℃培养24 h。弃上清，PBS 洗3 次；70%甲醇固定30 min；每孔加入100 μL 结晶紫染色液，5 min 后弃去染色液拍照观察；70%乙醇溶解BF，测定OD570nm值，数值越大则说明BF 越厚。

1.5.2 扫描电子显微镜观察细菌BF 的形成 将无菌玻片放入6 孔板中，按1：100 的比例加入浓度为1×108cfu/mL 菌液与培养基，后加入终浓度为1 MIC 的MPX，以菌液中加入ddH2O 为阴性对照。37 ℃孵育24 h 后，2.5%戊二醛溶液固定，不同浓度乙醇脱水，离子喷金镀膜，经扫描电镜观察。上述试验均每组作3 个重复。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0 软件处理数据和作图，并利用其中的One-Way ANOVA 或Two-Way ANOVA 对实验结果进行差异分析。P≤0.05为 差 异 显 著（文 中 标 注*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001）。

2 结 果

2.1 MPX 体外杀菌活性的检测结果采用琼脂扩散法检测MPX对EHEC的抑菌活性，结果显示，MPX在1 mg/mL 时能有效抑制EHEC 的生长，抑菌圈直径为9.7±0.2 mm，效果优于阳性对照组PR39差于阳性对照组Enro，阴性对照无抑菌活性。MIC 结果显示第1 孔到第6 孔MPX 的浓度分别为250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.62 μg/mL、7.81 μg/mL，前4孔内菌液均为清澈透明状，第5、6孔和阴性对照孔均变浑浊，则MPX对EHEC的MIC为31.25 μg/mL。

绘制的菌液OD600nm值变化曲线结果显示，4 MIC MPX 作用6 h 后，菌液的OD600nm值降至0.1，极显著低于阴性对照组（P＜0.01），效果优于阳性对照组Enro 和PR39；1 MIC MPX 处理组的菌液OD600nm值在前5 h 内高于Enro 和PR39 组，随后低于阳性对照组。阴性对照组的菌液OD600nm值始终最高（图1A）。绘制的活菌浓度变化曲线结果显示，EHEC 菌液经4 MIC MPX 作用6 h 后活菌数显著低于阴性对照组（P＜0.05），及PR39和Enro阳性对照组。而阴性对照组活菌浓度则持续上升（图1B）。扫描电镜观察结果显示，EHEC 经1 MIC MPX 作用2 h 后，菌体明显变小，细菌内容物渗漏。阴性对照组EHEC 形态饱满，菌体较大，且表面光滑（图1C）。上述结果表明，MPX在体外有较强的抑菌效果，且以4 MIC MPX 的抑菌效果最优，优于Enro 和PR39。

图1 MPX体外杀菌活性的检测Fig.1 Detection of the bactericidal activity of MPX in vitro

2.2 MPX 稳定性的检测结果稳定性试验结果显示，pH 值在3～8 的范围内对MPX 抑菌活性无影响，但当pH＞9 后MPX 的抑菌活性下降（图2A），且温度在20 ℃～100 ℃对MPX 的抑菌活性均无影响（图2B），表明MPX 具有较强的耐酸碱性和良好的热较稳定。

阳离子对MPX 的稳定性试验结果显示，不同浓度的一价阳离子Na+、K+对MPX 的抑菌活性均无影响（P＞0.05）；而二价阳离子Mg2+和Ca2+均可导致MPX抑菌活性的降低（P＜0.01）（图2C）。推测可能是二价阳离子导致MPX 二级结构的改变，从而影响其抑抗菌活性。

图2 酸碱（A）、温度（B）及阳离子（C）对MPX抑菌活性影响的检测结果Fig.2 The effect of acid,alkali(A),temperature(B)and cation(C)on the antibacterial activity of MPX

2.3 MPX 对EHEC 膜通透性影响的检测结果分别加入不同终浓度的MPX 至菌液中，2 h 后离心取上清，用BCA 试剂盒检测上清中的蛋白含量。结果显示，1 MIC 及2 MIC MPX 作用后的菌液上清蛋白含量均显著高于阴性对照组（P＜0.05、P＜0.01），但低于Gen 阳性对照组（图3A），表明1 MIC MPX 即可使菌体蛋白显著外泄。分别将不同终浓度MPX 加入EHEC 菌 液 中，24 h 后 加 入SYTO 9/PI，15 min 后 置激光共聚焦显微镜观察。结果显示，与阴性对照组相比，2 MIC MPX 作用后EHEC 中的红色荧光明显增多，1 MIC MPX 和0.5 MIC MPX 作用后的EHEC 中红色荧光较少，甚至无红色荧光（图3B），表明2 MIC MPX 能够显著破坏EHEC 细胞膜的完整性，PI 大量进入细菌内部与其DNA结合，导致死亡细菌（红色荧光）的数量明显增加。NPN 和DiSC3(5)染色结果显示，不同浓度MPX作用后（0～2 min）EHEC的荧光强度均明显增强，其后（2 min～10 min）不再变化（图3C、图3E），表明1 MIC MPX 即可迅速破坏EHEC 的细胞外膜，并致EHEC 细胞膜电位的去极化。将不同终浓度的MPX 分别加入EHEC 菌液中，10 min 后加入PI 染料避光孵育10 min，再使用酶标仪监测荧光强度。结果显示，不同浓度MPX 作用后（0～4 min）EHEC 的荧光强度均明显增强，其后（4 min～10 min）逐渐降低（图3D）。表明2 MIC MPX 才有显著的破膜效果。且上述C、D、E 各图中的阴性对照均无荧光，以上结果表明MPX 可以破坏EHEC 的细胞膜及外膜致其通透性增加，进而导致细菌死亡，且该作用效果基本与MPX 的浓度呈正相关。

图3 MPX对EHEC膜通透性影响的检测结果Fig.3 Detection of the effect of MPX on EHEC membrane permeability

2.4 MPX 对EHEC BF 形成影响的检测结果将不同终浓度的MPX 分别加入EHEC 菌液中，经结晶紫染色法检测MPX 对EHEC BF 形成能力的影响。结果显示，与阴性对照组相比，1 MIC～4 MIC 的MPX 均极显著抑制EHEC BF 的形成（P＜0.01、P＜0.001），且随着浓度的增加该抑制作用越强（图4A、图4B）。将1 MIC MPX 加入EHEC 菌液中，24 h 后经电镜观察，结果显示，1 MIC MPX 作用后的EHEC BF 结构松散且稀疏，粘附细菌数量减少，细菌间隙增大，阴性对照组的EHEC BF 结构紧密且厚实（图4C）。以上结果表明1 MIC MPX即能显著抑制EHEC BF的形成。

图4 MPX对EHEC BF形成影响的检测结果Fig.4 Detection results of the effect of MPX on the formation of EHEC BF

3 讨 论

近年来，抗生素滥用导致E.coli对抗生素产生了较强的耐药性，迫切需要开发抗E.coli感染的抗生素替代品。抗菌肽是机体先天免疫系统的重要组成部分，是抵御病原微生物侵入的第一道防线[8]。它具有抗菌谱广和不易使细菌产生耐药性等优点，备受各国研究者关注。杭柏林等的研究结果显示牛源抗菌肽BSN-37 对大肠杆菌ATCC25922 的MIC 为33.33 μg/mL[9]。徐欣欣等的研究结果显示，蛙源抗菌肽Magainin Ⅱ对大肠杆菌ATCC 25922的MIC为64 μg/mL，且Magainin Ⅱ的抑菌效果会被强酸和弱碱减弱，而受温度影响较小[10]。猪源抗菌肽PR39是一类富含脯氨酸和精氨酸的多肽，由39个氨基酸残基组成，相对分子量为4 719.7 U，具有广谱的抗革兰氏阳性、阴性菌及抗真菌等生物学功能，其对E.coliATCC25922 的MIC为4 μg/mL[11-12]。Enro是第三代喹诺酮类抗菌药物，其对E.coli的MIC 为3.125 μg/mL[13]。本 研 究 结 果 显 示MPX 在体外对EHEC 具有良好的抑菌活性，其MIC为31.25 μg/mL，小于抗菌肽BSN-37 和Magainin Ⅱ对大肠杆菌的MIC，但大于抗菌肽PR39 和Enro 对大肠杆菌的MIC，4MIC MPX 的体外抑菌效果优于终浓度为50 μg/mL 的PR39 和Enro，其抑菌效果受酸、弱碱、温度和一价阳离子浓度等因素的影响较小，提示MPX 可为治疗EHEC 感染提供新的选择。

抗菌肽因独特的抗菌机制成为近年来的研究热点，多数学者认为抗菌肽的杀菌机制主要是在细菌表面打孔，形成孔道，致使细胞膜结构破坏，造成胞内水溶性物质大量渗出，最终导致细菌死亡[14]。赵娅娅等发现抗菌肽JH-3 能够在1 h 内快速破坏金黄色葡萄球菌ATCC25923 的膜结构，导致其内容物（菌体蛋白）外泄，从而起到杀菌作用[3]。与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌的细胞外膜结构更复杂，且易导致细菌产生耐药性[15]。本研究通过EHEC 膜通透性试验发现，1 MIC MPX 作用后，EHEC 上清中的蛋白含量即显著增加，且2 MIC MPX 作用后EHEC 中的红色荧光明显增多；NPN 探针、PI 染料、DiSC3(5)探针的检测结果均显示，不同浓度MPX 作用后的EHEC 菌液荧光强度均增加，且基本均与MPX 的浓度呈正相关。以上结果表明，MPX 可导致EHEC 菌体蛋白外泄，破坏其细胞内膜和外膜的完整性，使其细胞膜电位去极化，增加菌体通透性，进而导致细菌死亡。

细菌BF 的形成可导致细菌耐药性的增加。Morroni 等发现抗菌肽LL-37 对多重耐药E.coli具有良好的抑菌活性，且MIC 和亚MIC 浓度的LL-37 均能够降低E.coliBF 的形成[16]。Vergis 等的研究结果显示，抗菌肽乳铁蛋白（17-30）对多重耐药肠聚集性的E.coli具有良好的抑菌和显著抑制其BF 形成的活性[17]。Mishra 等发现抗菌肽WW298 能够有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的粘附，且破坏其BF 形成的效果优于达托霉素[18]。本研究通过结晶紫染色和扫描电镜发现MPX（1 MIC）极显著抑制了EHEC BF 的形成（P＜0.01），表明抗菌肽MPX 有良好的抑制EHEC BF 形成的效果。

本研究为开发抗EHEC 感染的新药提供了实验依据。但是本研究仅对MPX 体外杀灭EHEC 的作用及效应进行了初步研究，药物在动物体内的作用效果如何尚待后续研究。