2020年我国部分地区禽偏肺病毒流行病学调查

肖志宇，王素春，赵成龙,4，黄禹丰,3，陈海燕,3，崔成都，孙福亮，王楷宬,4*

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032；2.延边大学，吉林 延吉 133000；3.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471023；4.青岛易邦生物工程有限公司动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东 青岛 266114）

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）早期被称为禽肺病毒，由于可感染火鸡导致鼻气管炎，也被称作火鸡鼻气管炎病毒。1980 年首次于南非被发现及报道，随后aMPV 迅速传播，在亚洲、非洲、欧洲、南美洲、北美洲等地均有aMPV 的报道[1]。aMPV 属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、肺病毒亚科（Pneumovirinae）[2]。根据编码附属糖蛋白G 基因的不同，aMPV 分为A、B、C 和D 亚群。aMPV 的基因组为一条不分节段的单股、负链RNA，呈螺旋对称包含在核蛋白壳中，长度约为13.5 kb[3]。

aMPV 是禽类上呼吸道的一种高度传染性病毒，可导致鸡的肿头综合征，以咳嗽、打喷嚏、下颌与面部肿胀、歪头斜颈、角弓反张为主要临床症状。若aMPV 感染鸡同时伴有其他致病细菌、病毒的继发感染时，会加重患病鸡病情，而且严重影响蛋鸡的产蛋量，给家禽养殖业造成严重的经济损失[4-6]。火鸡和鸡是aMPV 的自然宿主，各日龄鸡均易感染。另外，aMPV 还存在于麻雀、鸵鸟、海鸥、燕子和鸽子等鸟类，但这些鸟类对aMPV 不易感，仅仅是携带和传播病毒。C 亚群aMPV 也可以感染小鼠，可能是一种潜在的人畜共患病病原[7]。aMPV 具体的传播途径尚不清楚，aMPV 可以通过直接或间接接触患病的禽类传播，健康禽类接触患病禽类的呼吸道黏液即可感染发病。由于aMPV 主要感染上呼吸道，所以aMPV 也可以通过空气传播，尤其是通过空气中的悬浮颗粒传播[8-10]。另外aMPV 的传播还与野禽的迁徙、人员与仪器设备的流动、感染家禽的运输、污染的水源和饲养工具等相关。

近年来，aMPV 在我国流行，并造成严重影响。1998 年，沈瑞忠等首次于我国黑龙江地区分离并报道了该病毒[11]。2009 年，郭龙宗等发现山东省多地的种鸡群感染aMPV 的情况普遍存在[12]。2012 年，贠炳岭等发现在黑龙江、吉林、长春、河北等地的种鸡群中普遍存在aMPV 感染，多个种鸡场的血清aMPV 抗体阳性率达到100%[13]。2016 年，朱艳梅等对河南、河北、江苏等地区的种鸡群进行了调查，结果显示这些地区的种鸡群也普遍存在aMPV 的感染[14]。2017 年，张丹俊等的研究数据表明，安徽省不同地区不同品系的鸡群均存在较严重的aMPV 感染，且蛋鸡的感染率明显高于肉用和兼用型鸡的感染率[15]。

虽然该病毒在我国流行较广，但国内关于aMPV流行病学研究及致病特征的报道较少，因此本研究通过对福建省、四川省、广东省、江苏省的8 个地区采样，系统分析了aMPV 的流行情况。该研究不仅丰富了aMPV 的流行病学资料，也为研制其疫苗提供数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源及信息2020 年下半年从福建、江苏、广东、四川4 省共采集1 920 份禽咽喉/泄殖腔双拭子样品（每省480 份），置于含有10%甘油和抗生素的PBS 缓冲液。

样品宿主包括鸡、鸭、鹅、鸽。其中，鸡样品1 373 份，主要品种为白羽肉鸡、蛋鸡、乌鸡、三黄鸡等；鸭样品466 份，主要品种为番鸭、麻鸭等；鹅样品43 份，主要品种为乌鬃鹅、白鹅等；鸽样品38 份，主要为肉鸽（表1）。

表1 样品信息Table 1 Sample information

1.2 主要试剂PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）和PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 购自宝生物工程（大连）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒购自德国QIAGEN 公司。

1.3 样品处理及核酸提取拭子样品用漩涡振荡器震荡混匀，室温10 000 r/min 离心5 min。每个拭子样品吸取200 μL 加入96 孔加样槽中。按照QIAtractor 高通量核酸提取程序说明书提取RNA，放置于-80 ℃保存备用。

1.4 aMPV的多重荧光定量RT-PCR检测利用Prime ScriptTMRT-PCR Kit，以提取的基因组RNA 为模板，采用表2 中相应引物和探针，利用本实验室已经建立的aMPV 多重荧光定量RT-PCR 方法检测[16]。反应体系为50 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ25 μL，5 U/μL TaKaRa ExTaqHS 1 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1 μL，表2 中各亚群上、下游引物以及探针各1 μL，模板RNA 4 μL，ddH2O 7 μL。荧光定量RT-PCR 反应程序为：反转录42 ℃5 min；95 ℃10 s；94 ℃30 s，60 ℃30 s，40 个循环。

表2 引物和探针Table 2 Primers and probes

多重荧光定量RT-PCR 结果判定标准为：阴性对照无Ct 值且无扩增曲线；阳性对照的Ct 值≤36，并出现特异扩增曲线。待检样品通道无Ct 值并且无荧光扩增曲线，样品判为aMPV 阴性；出现ROX 荧光扩增曲线，且Ct 值≤36，没有HEX 荧光、FAM 荧光和CY5 荧光扩增曲线，则判定为A 亚群aMPV 阳性；出现FAM 荧光扩增曲线，且Ct 值≤36，没有HEX 荧光、ROX 荧光和CY5 荧光扩增曲线，则判定为B 亚群aMPV 阳性；出现HEX 荧光扩增曲线，且Ct 值≤36，没有FAM 荧光、ROX 荧光和CY5 荧光扩增曲线，则判定为C 亚群aMPV 阳性；出现CY5 荧光扩增曲线，且Ct 值≤36，没有HEX 荧光、ROX 荧光和FAM 荧光扩增曲线，则判定为D 亚群aMPV 阳性；同时出现两种或两种以上荧光，则为2 个亚群或多个亚群aMPV 混合感染。

1.5 数据分析根据样品宿主类别、来源、场点类型分析福建、四川、广东、江苏4省aMPV的感染情况。

2 结 果

2.1 aMPV 的检测结果为了解aMPV 在我国的流行情况，本研究从福建、江苏、广东、四川4 省采集活禽双拭子样品1 920 份，利用已建立的aMPV 四重荧光定量RT-PCR 方法检测，结果显示51 份样品为aMPV 阳性，其中39 份为B 亚群aMPV，7 份为C亚群aMPV，5 份为B、C 亚群混合感染aMPV。此外，39 份B 亚群aMPV 的感染宿主除1 份为鸽外其余38 份宿主均是鸡（38/1 373）；7 份C 亚群aMPV 感染的宿主有3 份是鸭，4 份是鸡（4/1 373）；5 份B、C 亚群aMPV 混合感染的宿主为鸡（5/1 373）。从宿主感染类型分析，鸡的阳性率为3.42%（47/1 373）且最易感染B 亚群aMPV；鸽的阳性率为2.63%（1/38）且易感B亚群aMPV；鸭的阳性率为0.64%（3/466）且均为C 亚群aMPV。结果表明，我国家禽中存在B 亚群和C 亚群的aMPV 感染，且首次发现了B、C 亚群混合感染的宿主鸡，鸡为aMPV 的主要宿主，并呈现对aMPV B 亚群易感。本研究未检测到鹅的阳性样品（表3），表明鹅可能并非aMPV 的主要宿主。

表3 临床拭子样品中aMPV的检测结果Table 3 Detection results of aMPV in clinical swab samples

2.2 不同场点类型和宿主aMPV 的检测及统计结果影响感染采集样品共来自33 个场点，其中，830份采自5 个批发市场，540 份采自13 个零售市场，440 份采自14 个养殖场，110 份采自1 个屠宰场。结果显示，批发市场有45个阳性样品，来自4个阳性场点，场点阳性率为80%（4/5）。零售市场有6 个阳性样品，来自3 个阳性场点，场点阳性率为23%（3/13）。养殖场、屠宰场未检测到阳性样品。宿主为鸡的阳性样品共47个，场点阳性率为12.12%（4/33），阳性样品中包括白羽鸡（19/47）、乌鸡（10/47）、清远麻鸡（10/47）、草鸡（3/47）、三黄鸡（3/47）、花凤鸡（1/47）、芦花鸡（1/47）。宿主为鸭的阳性样品共3 个，场点阳性率为9.09%（3/33），阳性样品中包括青头鸭（1/3）、番鸭（1/3）、连城白鸭（1/3）。宿主为鸽的阳性样品共1 个，场点阳性率为3.03%（1/33），阳性样品为肉鸽。结果表明，批发市场与零售市场多有个体散养户存在，其可能存在疫病防控意识不强，导致aMPV 感染家禽，而养殖场、屠宰场疫病防控检疫意识较强，未造成aMPV 流行，应加强个体散养户的疫病防控意识，本研究未检测到宿主为鹅的阳性样品。

2.3 不同地区aMPV 的流行情况统计分析结果对各省禽群中的aMPV 检测统计结果显示，福建省部分地区阳性率为0.63%（3/480）；四川省部分地区阳性率为3.96%（19/480）；广东省部分地区阳性率为3.54%（17/480）；江苏省部分地区阳性率为2.50%（12/480）。检测结果表明，福建、四川、广东、江苏4 省部分地区禽群中均存在aMPV 的感染，应立即采取相应措施，加强监管和控制该病的流行与传播。

3 讨 论

aMPV 在全球广泛流行，暴发时会快速传播，A和B 亚群aMPV 已经在中国、日本、以色列、巴西和大部分欧洲国家广泛传播[17-18]。而C 亚群aMPV 主要在美国、法国、中国和韩国被报道，D 亚群aMPV 仅仅在法国被报道。

aMPV 感染鸡群虽然死亡率低，但经常继发感染传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡支原体或其他病原体，使病情加重，死亡率显著提高[19]。aMPV 的流行速度快、传播范围广、造成损失大，而且国内多为血清学的流行病调查，本研究为病原学流行病调查，不仅丰富了aMPV的流行病学资料，也为aMPV感染的防控奠定了基础。

本研究采集1 920 份鸡、鸭、鹅、鸽的咽喉/泄殖腔双拭子样品，利用四重荧光定量RT-PCR 方法检测A、B、C、D 亚群的aMPV。结果显示，1920 份样品中共检出aMPV 阳性样品51 份，其中，B 亚群39 份，C 亚群7 份，B 亚群和C 亚群混合感染5 份。4个省aMPV 的阳性率为2.67%（51/1 920），各省阳性率为0.63%～3.96%；场点阳性率为21.21%（7/33）。进一步分析数据得知所有阳性样品均采样于零售市场和批发市场，而养殖场和屠宰场无阳性样品。在样品采集时零售市场样品主要以家庭散养成年家禽为主，批发市场样品来源复杂，既有家庭散养家禽也有养殖场饲养的家禽，还有家庭农场饲养的家禽，养殖场主要以采集规模化养殖场和养殖专业合作社的成年家禽为主，屠宰场样品均来自规模化养殖场。结合aMPV可在禽之间直接接触传播，也可通过间接接触不同媒介而发生水平传播，同时也能够通过空气传播的特性，推测有可能是因为现阶段集约化、规模化的家禽养殖场在饲养管理上较为科学，从而降低了aMPV 的感染。有文献报道，饲养管理不当是aMPV 感染禽的重要发病因素，调整饲养密度、控制饲养环境的通风及适宜温度、控制饲养环境的卫生，做好定期消毒工作可以有效降低该病的发病率[20]。在零售市场和批发市场存在大量散养禽类，可能由于其的饲养管理相对落后而出现较多的阳性样品。

陈秀琴等报道的福建省规模化鸡场aMPV 感染情况的血清学调查结果显示，部分地区的养殖场aMPV抗体阳性率高达100%[20]。张丹俊等对安徽省9 个鸡场aMPV 感染的血清学调查研究结果显示，所有被检鸡场均有aMPV 的感染[15]。张丽华等对广西地区规模化鸡场aMPV 感染的血清学调查研究结果显示，不同日龄不同品系的鸡群均存在较严重的aMPV 感染[21]。朱艳梅等对aMPV 病原学的调查显示，江苏、辽宁、河南、山东、河北等地有肿头症状鸡群中aMPV 的阳性检出率高达50.7%[14]。从中随机抽取9个样品进行基因序列分析，结果显示，9 个样品均为B 亚群aMPV。该研究结果aMPV 的阳性率比本研究的阳性率高是由于本研究采样时并未针对肿头症状禽群。对于aMPV的流行病学调查大多为血清学调查，本研究采用病原学方法检测且采样时并未针对肿头症状禽群而是健康禽群，这说明健康禽群aMPV 阳性率远低于肿头症状禽群，这也是导致本研究结果与以上研究结果不一致的原因之一。而且有研究表明在aMPV 单一感染中，火鸡大约在感染的14 d 内即可恢复正常。当饲养管理条件不佳或发生继发性细菌感染时均可增加发病率和死亡率。本研究样品大多采自成年商品家禽，可能样品个体有一过性aMPV 感染，并快速清除了体内抗原，但抗体仍然在体内持续存在，这是导致本研究与血清学调查结果差异显著的主要原因。

aMPV 检测结果显示四川省感染aMPV 的禽类较多。本研究表明，我国鸡群中主要感染B 亚群aMPV，鸡群仍然是感染aMPV 的主要宿主，且在鸡群中存在B 亚群与C 亚群的混合感染。鸭群中存在C 亚群aMPV 感染，鸽群中存在B 亚群感染。2014 年有研究人员发现番鸭中存在aMPV 感染[22]，2012 年有研究人员发现鸽群中存在aMPV 感染[23]。aMPV 的感染使鸡群处于免疫抑制状态，易造成鸡群免疫失败同时增加了其他病原感染风险。因此，需要加强aMPV 的流行情况监测。

本研究调查结果不仅丰富了我国aMPV流行病学资料，同时也为福建、四川、广东、江苏4 省部分地区aMPV感染的防控提供技术支持，为开展aMPV病原学、检测技术以及疫苗的研发等相关研究提供科学依据。