福建省2018年～2020年非免疫鸡群滑液囊支原体感染的流行病学调查

王晨燕，罗忠宝，黄宝钦，江 斌，张世忠，邵国青,3，侯 博*

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病疾病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013；2.福建圣农发展股份有限公司，福建 南平 353499；3.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014）

滑液囊支原体（Mycoplasma synovia，MS）是感染鸡和火鸡的一种致病性病原体，全年均可感染，广泛存在于世界范围内的各鸡群，主要引起传染性滑膜炎和腱鞘炎以及亚临床的呼吸道症状。MS 具有水平传播和垂直传播的能力，临床MS 感染主要表现为上呼吸道亚临床症状或无症状，产蛋鸡出现产蛋量和鸡胚孵化率下降[1]，以及商品肉鸡饲料报酬率和胴体品质等级均降低[2]。此外，MS 感染还引起鸡胚蛋壳顶端异常（Eggshell abonormalities，EAA），且感染MS 的鸡群易诱发感染新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌等，给家禽业带来了极大的经济损失[3-4]。MS只有一个血清型，但不同MS分离株的致病性不同[5]，同一MS分离株不同感染途径的致病力也不同[6]，从病变气囊分离的菌株较易引起气囊炎，从滑膜分离的菌株较易引起滑膜炎[7]。目前主要通过对培养物或组织样品的可变脂蛋白血凝素A（Variable lipoprotein hemagglutinin，vlhA）基因测序并进行遗传进化分析研究MS[8-9]。临床多采用抗生素治疗MS 感染，但经过长期抗生素的使用也不能彻底根治MS 感染，抗生素治疗仅能减轻感染和降低MS的传播速度[10]。

我国鸡群MS 感染率最近几年持续上升，目前已广泛存在于全国各地鸡群中，包括蛋鸡、白羽肉鸡和黄鸡。通过血清学调查（ELISA 法）发现2010 年～2015 年我国16 个省9 773 个肉鸡群中存在MS 感染[11]。Xue 等发现2010 年～2015 年中国21 个省份未免疫鸡群血清MS 抗体总阳性率为41.19%，且MS 可感染任何日龄鸡群[12]。为避免血清采样对产蛋鸡群的应激，Gole 等对澳大利亚19 个商业蛋鸡群的鸡胚卵黄抗体进行抗体检测，结果发现MS 抗体阳性率为69%，产蛋鸡群存在较为严重的MS 感染[13]。

为了解福建省商品蛋鸡和肉鸡群中MS 流行情况，本研究采用ELISA 法对蛋鸡群进行血清抗体检测，利用实验室建立的TaqMan qPCR 方法对肉鸡群的上颚裂拭子进行MS 检测；同时为了解MS 在蛋鸡群中的感染规律，选取3 个非免疫蛋鸡群定期跟踪检测MS 抗体的同时利用TaqMan qPCR 方法对上颚裂拭子进行MS 病原检测；同时对不同年份和地区的MS 分离株进行vlhA基因系统进化树分析，以了解和掌握2018 年～2020 年福建地区MS 感染情况和规律，为科学防控MS 感染奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料MS-H 株商品化疫苗购自澳大利亚生物资源有限公司；MS ELISA 抗体检测试剂盒购自BioChek 公司；GoTaqGreen Master Mix（M7123）购自普洛麦格（北京）生物有限公司；2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）购自北京擎科生物科技有限公司；引物和探针由北京擎科生物科技有限公司合成；细菌DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 样品采集1 668 份蛋鸡血清样品来自2018 年～2020 年福建4 个地市不同规模化MS 非免疫蛋鸡养殖场，其中福州834 份，漳州552 份，莆田153 份，南平129 份。2 777 份肉鸡上颚裂拭子样品来自福建不同规模化白羽肉鸡养殖场，其中2018 年、2019 年和2020 年分别采样981 份、793 份和1 003 份。选取不同地方的A、B 和C 3 个MS 非免疫蛋鸡鸡群（每个鸡群规模约为5 万羽），从雏鸡进厂（1 周龄～2 周龄）至产蛋前（12 周龄～18 周龄）每月分别采集血清和上颚裂拭子样品至少40 份，并一一对应。

1.3 蛋鸡群中MS 抗体检测及MS 感染流行规律分析采用MS 抗体检测试剂盒，对采集的血清样品进行检测。检测结果判定标准：S/P 值≥0.500 或效价范围≥594，判为阳性，反之判为阴性。根据检测结果分析蛋鸡群MS 感染流行规律。

1.4 蛋鸡群及肉鸡群中MS 的TaqMan qPCR 检测及MS感染流行规律分析取上颚裂拭子样品2 000 r/min离心5 min；取上清液1 mL（或MS 纯培养物）置于1.5 mL 离心管中，4 ℃12 000 r/min，离心10 min，弃上清液，采用细菌DNA 提取试剂盒提取沉淀中MS 基因组DNA 作为模板进行qPCR 扩增。

利用本实验室建立的针对MSobg基因的TaqMan qPCR 方法，对上颚裂拭子样品进行MS 的检测。检测总体积20 μL，反应体系为：2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL，引物MS-F（5'-TAAAGTTCCGCTTGGAACGC-3'） 或MS-R（5'-GCAATTCTAGGAGCGGTGTT-3'）（10 μmol/L）各0.7 μL，探针MS-P（5'-FAM-TTATTA TTTCCTCTTCCGCC-MGB-3'）（10 μmol/L）0.6 μL，dd H2O 4 μL，DNA 模板4 μL；反应条件：95 ℃2 min；95 ℃10 s、60 ℃35 s（收集FAM 荧光信号），40 个循环。每次试验以疫苗株MS H 株为阳性对照，以无菌水作为阴性对照。检测结果判定标准为：当阳性对照Cq 值＜25，阴性对照无Cq 值时，则阴阳性对照成立；当样品Cq 值≤35，判定为“+”；35＜Cq 值＜38，判定为弱阳性或可疑；Cq 值≥38，判定为“-”；当样品判定为弱阳性或可疑时，重复检测一次仍为可疑或弱阳性，则判为阳性。根据检测结果分析蛋鸡和肉鸡群MS 感染流行规律。

1.5 MS vlhA 基因的进化树分析对1.4 中不同来源MS阳性样品中获得的18株分离菌株（表1）进行vlhA基因PCR 扩增，引物序列如下：vlhA-F：5'-GGCCAT TGCTCCTRCTGTTAT-3'/vlhA-R：5'-CCCGTCTCAGT ATAGTGTACG-3'。总体积25 μL，反应体系：GoTaqGreen Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dd H2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL；反应程序为：95 ℃5 min；95 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃90 s，共35 个循环；72 ℃10 min；以MS H 株为阳性对照。将PCR 产物经克隆后挑取单个菌落在LB 培养基培养后提取质粒由福州博尚生物公司测序，并利用MEGA7 软件采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）法构建vlhA基因的系统进化树。

表1 MS病原阳性分离株来源背景Table 1 Source and background of MS isolated strains from positive samples

1.6 统计学分析利用SPSS19.0 软件进行统计学分析。采用χ2检验及其事后两两比较不同年份、不同日龄鸡群的MS 抗体和MS 病原检测结果是否存在显著性差异，当P＜0.05 表示差异显著。

2 结 果

2.1 蛋鸡群中MS 抗体检测结果及MS 感染流行规律分析采用ELISA 抗体检测试剂盒对1 668 份福建未免疫蛋鸡群血清样品进行检测，结果显示蛋鸡血清中MS 抗体总阳性率为64.09%（1 069/1 668），呈逐年下降趋势，2018 年为79.92%，2019 年和2020 年分别为77.21%和38.58%，经统计学分析显示2018 年与2019 年MS 抗体阳性率无显著差异（P＞0.05）；2018 年MS抗体阳性率与2020年存在显著差异（P＜0.05），2019年MS 抗体阳性率与2020 年存在显著差异（P＜0.05），2018 年MS 抗体阳性率与2019 年无显著差异（P＞0.05）（图1）。不同月龄蛋鸡MS 抗体阳性率随月龄增加呈上升趋势：其中1 月龄～6 月龄蛋鸡血清MS 抗体阳性率各月龄分别为4.40%、17.40%、43.26%、80.00%、76.31%和76.44%，7 月龄～15 月龄蛋鸡血清MS 平均抗体阳性率为92.17%（图2）。结果表明2018 年～2019年福建地区蛋鸡群存在严重的MS 感染，且随着月龄增加，感染率显著上升，提示在鸡群中存在着严重的MS 水平传播现象。

图1 不同年份蛋鸡血清MS抗体检测结果及SPSS分析Fig.1 SPSS analysis of MS antibody positive rate in layers at different years

图2 不同月龄蛋鸡血清MS抗体检测结果及SPSS分析Fig.2 Detection results and SPSS analysis of MS antibody in serum of laying hens of different ages

2.2 肉鸡群中MS TaqMan qPCR 检测结果及MS 感染流行规律分析采用TaqMan qPCR 对不同肉鸡群的2 777 份上颚裂拭子样品检测，结果显示肉鸡群中MS 总阳性率为49.62%（1 378/2 777），其中2018 年、2019 年和2020 年分别为43.83%、51.58%和53.73%，经统计学分析结果显示2019 年与2020 年MS 阳性率无显著差异（P＞0.05），但2018 年MS 阳性率与2019年存在显著差异（P＜0.05），2018 年MS 阳性率与2020 年存在显著差异（图3），表明MS阳性率逐年升高。随着肉鸡日龄增加，0～7 d、8 d～14 d、15 d～21 d、22 d～28 d、29 d～35 d 和36 d～42 d 的MS 检测阳性率分别为0、24.00%、35.29%、68.49%、72.53%和88.91%（图4），结果表明MS 在肉鸡群中的阳性率随鸡群日龄增加而增加，在鸡群中存在着严重的MS水平传播。

图3 不同年份肉鸡MS病原检测结果及SPSS分析Fig.3 Detection results and SPSS analysis of MS pathogen positive rate in broilers at different years

图4 不同日龄肉鸡MS病原检测结果及SPSS分析Fig.4 Detection results and SPSS analysis of MS pathogens in broilers of different ages

2.3 蛋鸡群MS 抗体和MS 检测结果的比较与分析对不同来源、不同品种的3 个非免疫蛋鸡群定期进行MS 抗体和MS 检测，结果显示鸡群A 在1 周龄和5 周龄、10周龄、18周龄时MS阳性率分别为100.00%、100.00%、97.5%、80.00%，而同期的MS 抗体阳性率分别为65.00%、66.70%、77.50%、95.00%（图5A）；鸡群B 中1 周龄和5 周龄的MS 抗体和病原阳性率均为0，第9 周龄开始MS 抗体阳性率为7.50%，而MS病原阳性率为52.50%，第13 周龄MS 抗体阳性率32.50%，MS 病原阳性率为77.50%（图5B）；鸡群C 中2 周龄～16 周龄的MS 抗体和MS 病原阳性检出率均为0（图略）。结果表明BioChek MS 抗体检测试剂盒与TaqMan qPCR病原检测方法在鸡群MS检测中结果差异较大，并且不同鸡群MS 感染情况不同，在1 周龄～2 周龄时MS 和MS 抗体阳性率的不同可能是由于部分鸡群存在垂直传播现象和母源抗体，而B 鸡群在后期MS 阳性检出率增加可能是鸡群通过水平传播感染MS 后又进一步在鸡群内部发生了严重的水平传播。

图5 非免疫蛋鸡群血清MS抗体和上颚裂拭子MS病原检测阳性率的比较Fig.5 Comparison of positive rates of MS antibody in serum and MS pathogen in oropharyngeal swabs from non-immunized laying hens

2.4 MS vlhA 基因的进化树分析对表1 不同来源的阳性样品中分离获得的18 株MS 菌株通过PCR 扩增vlhA基因并测序，分析其同源性并构建其系统进化树，结果显示18 株福建MS 分离株vlhA基因序列同源性为80.32%～97.14%，进化树显示分离株来源广泛，且分属于不同的进化树分支，与国外MS 菌株的亲缘关系较近（图6）。该结果表明福建地区感染的MS 来源复杂，且MS 分离株具有不同的遗传背景，可能是由于引种或鸡群流动所致。

图6 MS vlhA基因系统进化树Fig.6 Using MEGA7 software to construct the phylogenetic tree of MS vlhA gene by NJ method

3 讨 论

临床通常采用ELISA、PCR、HI 等多种方法检测鸡群中的MS[14]。本研究采用ELISA 方法对福建非免疫蛋鸡群开展MS 感染调查，结果显示，2018 年～2020 年蛋鸡MS 抗体总阳性率为64.09%，且不同日龄蛋鸡群MS 抗体均有阳性，表明MS 能感染各年龄段蛋鸡，并在鸡群存在严重的水平传播，与其他研究结果一致[12]；在蛋鸡群中MS 抗体阳性率在2 月龄～4 月龄出现显著升高，有报道56 日龄SPF 鸡攻毒试验中，经脚垫注射或气管注射感染MS，鸡群感染后10 d 开始产生抗体，而经点眼感染在感染后20 d抗体开始转阳[6]，以上结果表明MS 感染的发生远远早于抗体检测阳性的时间，抗体检测具有严重的滞后性。此外，ELISA 检测的非免疫蛋鸡群来源均不同，已有研究表明MS 水平传播的潜伏期通常为11 d～21 d[15]，经种蛋垂直传播时雏鸡出壳后潜伏期最长为6 d[16]，本研究1 月龄的蛋鸡群抗体阳性率为4.4%，推测存在垂直传播或有母源抗体。通过建立的TaqMan qPCR 法对肉鸡上颚裂拭子检测发现22 日龄～28 日龄肉鸡MS 阳性率已超过50%，且随着日龄增加，阳性率显著升高，至出栏前达到88.91%，表明MS 同样在肉鸡群中出现了严重的水平传播，且潜伏期至少需要21 d～28 d。因此，本研究表明福建地区2018 年～2020 年在非免疫鸡群中存在严重的MS 感染，应在MS 感染前即至少提早4 周采取有效的控制和预防策略阻止MS 感染。

鸡群感染不同MS 菌株或不同剂量的MS 后的血清学反应过程大致相同，低剂量感染组鸡群MS 抗体产生时间较高剂量感染组延迟7 d[17]。本研究对3 个非免疫蛋鸡群MS 和MS 抗体同时检测结果提示，临床采用ELISA 方法检测出的MS 抗体阳性率可能低于鸡群实际MS 感染率。在非免疫蛋鸡群A 中1 周龄雏鸡MS 阳性率为100%，MS 垂直传播较为严重，MS 抗体水平随时间呈上升趋势，采用抗生素治疗后10 周龄鸡MS 阳性率有所下降但效果并不理想；在非免疫蛋鸡群B 中，仅需4 周MS 的阳性率即超过50%，而建立的MSTaqMan qPCR 法的检测限为102CCU50，推测实际鸡群可能同时存在MS 水平传播和垂直传播，由于不同鸡场管理方式和生物安全措施不同，MS 感染规律存在差异。产蛋鸡开产后若存在MS 感染可对产蛋性能和蛋品质造成一定影响[13]，因此很有必要利用TaqMan qPCR 法在鸡群早期定期监测MS，特别是在蛋/肉鸡引种后和蛋鸡开产前，了解不同鸡群MS垂直传播以及感染规律，并提前采用支原体敏感药物或其他方法防治MS 的感染，可能会降低MS 临床感染率。

临床上不仅存在呼吸道嗜性和关节嗜性的MS 菌株，还存在输卵管嗜性的菌株，MS 菌株之间的差异与其致病性和病程有关，而了解MS 菌株的分子特征有助于对其的流行病学研究[5]。vlhA基因是近几年发现的针对MS 分子研究的靶基因，针对该基因的PCR检测方法和根据该基因进行的MS 基因分型已经十分成熟[5,18-19]。本研究通过对vlhA基因序列分析，发现18 株MS 福建分离株vlhA基因序列分属于不同的进化树分支，这可能是由于鸡场引种的来源不同，李凡等发现川西地区MSvlhA基因的变异较大[20]，Sun 等发现中国本土地方品种鸡群MS 主要分离株的基因型为K 型，为中国特有MS 基因型[11]。尽管MS 分型是依据vlhA基因，但MS 菌株的毒力仍然存在高度变异性，表现出呼吸道症状的鸡群分离出的MS 菌株基因型可能存在不同[9]，因此临床有必要对MS 分离株开展相关致病性试验，以了解其致病特征。因此，本研究结果提示福建地区感染的MS 来源复杂，与国内地方品种鸡群MS 分离株的来源不同，且具有不同的遗传背景，很有可能是通过引种或鸡群流动所致其来源背景复杂。

因此，本研究结果表明不同日龄的非免疫鸡群均存在广泛的MS 感染和严重的水平传播；通过对3个非免疫蛋鸡群的MS 抗体和MS 持续跟踪检测表明不同鸡群MS 感染的时间存在差异，其或许与鸡苗来源和垂直传播或生产管理相关，而且ELISA 法检测结果相较qPCR 在早期感染检测中存在滞后性；此外由于不同鸡场生产管理方式和采取生物安全措施不同，MS 感染潜伏期也存在差异。通过vlhA基因测序发现不同MS 分离株属于不同的进化分支，有着不同的遗传背景，与国外MS 菌株的亲缘关系较近，提示在以后引种等过程中需要加强MS 检测。