TLR4在皮肤鳞状细胞癌细胞的表达及其对细胞迁移和侵袭的影响

胡新红，曹天宇，刘 涛，王小霞，吕雅洁

(中国人民解放军空军军医大学第二附属医院皮肤科，西安 710038；* 通讯作者,E-mail:yajie_lv@163.com)

鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是常见的皮肤恶性肿瘤，目前在全球范围内的发病率不断增加[1]。虽然许多因素会增加SCC的风险，但有研究显示SCC风险似乎仅与长期累积阳光暴露有关，尤其是在儿童和青年时期最为重要[2]。此外，SCC也是大多数非黑色素瘤皮肤癌相关转移性疾病发生和死亡的原因[3]。组织病理学和正确的手术切除仍然是SCC诊断和治疗的金标准[4]。

Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一种膜蛋白受体，也是机体先天免疫系统的关键组成部分[5]。同时，TLR4在人类皮肤、角质形成细胞以及皮肤鳞状细胞癌中均表达[6]，其在皮炎、银屑病、SCC和黑色素瘤以及皮肤伤口愈合等皮肤病中均扮演重要作用[7,8]。据报道，TLR4信号传导以MyD88依赖性方式促进SCC的发展，并且是癌变过程中炎症细胞募集所必需的[9]。另外，TLR4与细胞外皮肤液中人高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB-1)的相互作用，会导致角质形成细胞中核转录因子的激活，进而促进上皮肿瘤的发展[10]。同时，TLR4还通过激活T细胞，在预防化学诱导的致癌作用中发挥作用[11]。TLR4在支持细胞生长或诱导凋亡信号中的作用，主要通过激活其他细胞群来呈现[12]。然而，TLR4可能发挥抗肿瘤或促肿瘤作用，但这取决于肿瘤类型以及它是否在肿瘤细胞或免疫细胞中表达[13]。虽然有报道称，TLR4在皮肤SCC中发挥抗肿瘤作用[14]，但TLR4影响SCC细胞水平的机制却不清晰。本研究通过分析临床SCC样本特征以及SCC细胞系中TLR4的表达变化和细胞生理功能变化，旨在分子和细胞水平探讨TLR4在SCC细胞中的表达水平，以及对SCC细胞迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人皮肤鳞状细胞癌细胞系(A431、HSC-1和HSC-5)和正常的永生化人角质形成细胞系HcCaT购于美国ATCC菌株保藏中心；脱脂牛奶、过氧化氢、氯仿、异丙醇购于上海生工有限公司；柠檬酸购于恒信生物技术有限公司；一抗TLR4、β-actin、HRP标记山羊抗IgG、二抗抗鼠免疫球蛋白IgG购于美国Abcam公司；显色底物二氨基联苯胺试剂盒购于成都欣亿维生物科技有限公司；胎牛血清、DMEF高糖培养基购于美国Gibco公司；BCA分析试剂盒、结晶紫和Lipofectamine 2000购于碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购于美国Millipore公司；Trizol试剂、RNA prep pure Tissue Kit和PrimeScript RT合成试剂盒和SYBR®Green qRT-PCR Master Mix试剂盒购于美国Thermo公司；Transwell购于无锡耐思生命科技股份有限公司；所有引物合成于上海生工有限公司。

1.1.2 组织样本 于2018年3月至2020年12月在中国人民解放军空军军医大学第二附属医院收集和分离了80例SCC患者和70例鲍温病(Bowen disease，BD)患者的组织样本，同时收集了40例正常健康受试者的组织样本。所有患者均未接受过包括化疗或放疗在内的术前治疗。本研究所有参与患者均获得知情同意，本研究已获本院伦理委员会审查批准(伦理审批号：201801180023)。所有病例均仔细复查，病理诊断均按照WHO分类[15]。

1.2 方法

1.2.1 皮肤鳞状细胞癌患者的临床特征分析 统计分析80例SCC患者和70例鲍温病患者的基本临床特征，包括年龄、性别和病变部分的分布。患者病变部位分布分析主要包括头、脸、手臂、手、身体、外阴、腿和脚，剩余的病变部位均归为其他。

1.2.2 免疫组织化学法检测蛋白表达水平 SCC组织样本经切片脱蜡，经过氧化氢处理5 min，抑制内源性过氧化物酶活性。滴加山羊血清封闭液，并使用柠檬酸液修复抗原。将SCC组织样本与鼠抗TLR4(1∶200)于4 ℃孵育过夜。PBS冲洗2次，每次3 min；然后与HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)，室温孵育1.5 h；用PBS冲洗2次，每次3 min。最后，使用显色底物二氨基联苯胺试剂盒检测主要抗体。如文献[16]所述，使用显微镜观察免疫组织化学染色的图像，同时使用Image J软件对蛋白表达水平进行定量分析。

1.2.3 细胞培养 本研究中所使用的细胞系包括人皮肤鳞状细胞癌细胞系(A431、HSC-1和HSC-5)和正常的永生化人角质形成细胞系HcCaT。A431、HSC-1和HSC-5细胞和HcCaT细胞所使用的培养基为DMEF高糖培养基。所有细胞的培养条件为37 ℃、5% CO2，培养基添加10%胎牛血清。

1.2.4 蛋白质印迹检测TLR4蛋白的表达水平 收集各组细胞培养液，离心收集细胞沉淀(4 ℃，3 000 r/min，5 min)，超声裂解细胞(180 W，3 min)，然后低温高速离心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)，分离上清液，使用BCA分析试剂盒检测蛋白浓度。采用10% SDS-PAGE分离蛋白，然后转移到PVDF膜上，于室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h；将膜与一抗TLR4(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000)分别在4 ℃下孵育过夜。然后将它们与二抗抗鼠免疫球蛋白IgG(1∶2 000)在室温下孵育1 h。采用增强化学发光剂检测目的蛋白的表达水平。使用Image Lab软件(Bio-Rad Laboratory)对斑点进行半定量。

表1 本实验所用引物

1.2.6 小干扰RNA转染和分组 待人皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞系(A431、HSC-1和HSC-5)和正常的永生化人角质形成细胞系HcCaT生长到细胞皿的80%～90%时，根据使用说明书，采用Lipofectamine 2000对HcCaT、A431、HSC-1和HSC-5细胞系分别转染针对TLR4的5 nmol/L的si-TLR4(作为转染组)或对照siRNA(作为对照组)。引物信息见表1。

1.2.7 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况 如文献[14]所述，使用Matrigel包被的Transwell进行各组的细胞侵袭和迁移试验。将50 μl的Matrigel(2 mg/ml)加入Transwell的上室，在37 ℃下孵育30 min。随后，将4×103细胞接种在无血清的DMEM培养基中；在下室加入含10%胎牛血清的600 μl培养基作为化学诱导剂，孵育24 h后，用棉签清除未侵入的细胞。将侵入下膜的细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min，并用0.1%结晶紫在室温下染色20 min，在显微镜下(德国卡尔·蔡司)拍摄并计数入侵和迁移的细胞数，共选择5个随机视野进行细胞计数，并计算平均值。

1.3 数据统计分析

2 结果

2.1 皮肤鳞状细胞癌患者的临床特征

80例SCC患者和70例BD患者的临床特征显示，SCC患者和BD患者的平均年龄分别为(72.54 ±3.47)岁和(73.62 ±3.19)岁；从性别分布上看，SCC患者中男性和女性比例为38∶42，BD患者中男性和女性比例为21∶49(P=0.02)；从病变部位分布上看，病变位于面部和暴露在阳光下的部位(头和手)在SCC患者和BD患者中分别为45%(共44例)和40%(共28例)，病变位于身体非曝光部位(手臂、身体、外阴、腿和脚)在SCC患者和BD患者中分别为55%(共36例)和60%(共42例)。

2.2 TLR4在皮肤鳞状细胞癌组织中高表达

免疫组织化学评估皮肤肿瘤中的TLR4阳性表达的结果显示，正常表皮组织中淡黄色至棕褐色颗粒(阳性染色)分布较稀疏，BD患者病变表皮组织中淡黄色至棕褐色颗粒分布呈带状、较密集，SCC患者病变表皮组织中淡黄色至棕褐色颗粒数量多，分布密集(见图1)。与邻近的正常表皮组织相比，BD和SCC患者病变组织中TLR4阳性表达均升高，差异具有统计学意义(P<0.05，见图2)。

图1 TLR4在SCC和BD组织中高表达 (DAB染色,×400)Figure 1 High expression of TLR4 in SCC and BD tissues (DAB,×400)

与正常组织相比，* P <0.05，* * * P <0.001

2.3 TLR4在皮肤鳞状细胞癌细胞系中mRNA和蛋白质表达水平

RT-qPCR和Western blotting结果显示，与对照组HcCaT细胞系相比，转染组SCC细胞系A431、HSC-1和HSC-5中TLR4的mRNA和蛋白质表达水平均显著升高(P<0.01，见图3)。与对照组相比，转染组中各SCC细胞系A431、HSC-1和HSC-5中TLR4的mRNA和蛋白质表达水平均显著下降(P<0.01)；但转染si-TLR4后，SCC细胞系A431、HSC-1和HSC-5中TLR4的mRNA和蛋白质表达水平仍高于HcCaT细胞系(P<0.05，见图3)。

对照组与HcCaT细胞相比，* * P <0.01；转染组与HcCaT细胞相比，& P <0.05，&& P <0.01；同种细胞与对照组相比，## P <0.01

2.4 si-TLR4增强了皮肤鳞状细胞癌细胞的迁移

细胞迁移实验结果显示，与对照组相比，转染组中HcCaT细胞和SCC细胞系中A431、HSC-1和HSC-5的细胞迁移数量均显著升高(P<0.01，见图4)。

2.5 si-TLR4增强了皮肤鳞状细胞癌细胞的侵袭

细胞侵袭实验结果显示，与对照组相比，转染组中HcCaT细胞和SCC细胞系中A431、HSC-1和HSC-5的细胞侵袭数量显著升高(P<0.01，见图5)。

与对照组比较，* * P <0.01，* * * P <0.001

3 讨论

人类表皮肿瘤最常见的形式包括脂溢性角化病、癌前病变如鲍温病或鲍温样丘疹病，以及基底细胞癌或鳞状细胞癌[17]。鳞状细胞癌始于局部侵袭性恶性皮肤肿瘤[18]，非典型鳞状细胞的癌巢起源于表皮的不同层，并不规则地延伸到真皮中[19]。鳞状细胞癌的恶性和转移潜能都比较高，已确认某些形式的肿瘤发生与慢性炎症密切相关；也有报道慢性乙型肝炎可诱发肝细胞癌，慢性胃炎或胃溃疡可诱发胃癌[20]。然而，TLR4相关炎症在鳞状细胞癌发展中对细胞的迁移和侵袭的影响，以及所起的作用仍然知之甚少。本研究旨在通过分子和细胞水平，探究TLR4在SCC细胞中的表达水平，以及对SCC细胞迁移和侵袭的影响，以期进一步解析TLR4在鳞状细胞癌发生发展中的机制，为临床领域应用研究提供一定的支持。

本研究中SCC患者中病变位于面部和暴露在阳光下的部位为45%，这与文献中的数据基本符合，研究报道较多SCC患者病变均出现在暴露在阳光下的皮肤上，例如前额、面部、耳朵、头皮、颈部和手背[21]。同时本研究检查了TLR4在非黑素细胞皮肤癌BD和SCC中的表达水平，结果显示BD和SCC患者的病变组织中TLR4阳性表达水平显著提高，且SCC患者TLR4的阳性表达水平也明显高于BD患者。

SCC被认为是一种癌前病变SCC，这种病变会发展演变为侵袭性SCC[22]。研究表明，从正常皮肤逐渐病变的过程中，组织样本中角质形成细胞中TLR4的表达会显著增加[23-25]，这些结果表明TLR4表达可能还参与皮肤SCC的形成和进展。本研究表明，与HcCaT(正常的永生化人角质形成细胞系)相比，SCC细胞系A431、HSC-1和HSC-5中TLR4的mRNA和蛋白质表达水平均显著提高。这结果也表明，在SCC形成的过程中，TLR4的表达会逐渐增强。

另外，本研究还发现了一个有趣的现象，在SCC细胞系HSC-1和HSC-5中，TLR4 siRNA转染的HSC-5细胞中TLR4 mRNA和蛋白水平比HSC-1细胞系中TLR4 mRNA和蛋白水平显著降低。文献表明，HSC-1是一种源自低分化人类手部皮肤SCC的细胞系且细胞生长表现出角化特征，例如异种移植小鼠模型中的角质和单个细胞角化[26,27]；而HSC-5是一种源自分化良好的人耳廓皮肤SCC的细胞系，缺乏角化能力[28]。同时HSC-1和HSC-5细胞角蛋白表达水平不同。HSC-1和HSC-5细胞之间对TLR4 siRNA反应性的差异可能是由这些细胞生物学差异引起。文献表明，在HSC-5细胞中缺乏TLR4蛋白，当成功敲低后可能影响细胞迁移和CD44表达[23]。这些结果可能是由于HSC-1和HSC-5细胞之间的细胞生物学差异，例如mRNA和蛋白质之间的稳定性差异，或蛋白质降解过程的差异。未来我们也将使用更多SCC细胞系并提供更多证据来支持本研究的结果。

同时，还研究了TLR4的表达对SCC细胞迁移和侵袭的影响。文献表明，从细胞边缘伸出的细长指状膜突起，可能会影响细胞迁移和细胞侵袭[29]。已有研究报道，某些特殊的Toll样受体可以通过活化T细胞以发挥其抗肿瘤作用，如TLR4配体可以通过MyD88依赖性途径间接诱导Th1抗肿瘤免疫应答而实现肿瘤抵抗[30]；或通过促进癌细胞凋亡和抑制增殖来发挥抗肿瘤作用，如通过活化TLR2信号而激活Fas/FsaL介导的途径来促进小鼠结直肠癌上皮细胞系CT26凋亡，并抑制了肿瘤细胞的增殖[31]。本研究中，TLR4在SCC细胞系中高表达，通过siRNA干扰实验，发现与对照siRNA转染的HaCaT细胞相比，敲低TLR4的表达促进了细胞的迁移和侵袭，这表明TLR4在SCC的发生发展中存在一定的抗肿瘤作用，这与前人的研究结果也一致。

综上所述，TLR4对皮肤SCC的发生和发展具有抑制作用，抑制的TLR4的表达可能会促进皮肤SCC的恶化进程。未来，我们的目标是研究TLR4在上皮-间质转化中的作用，这与癌细胞迁移和侵袭性密切相关。