自发性高血压大鼠年龄相关性左心室肥厚的动态变化

易达松，袁善斌，曾俊义，赵健清，丁 露，文 通，聂俊刚

(南昌大学第一附属医院 1.心血管内科； 2.江西省高血压病研究所，江西 南昌 330006；3.江西省信丰县人民医院 重症医学科，江西 信丰 341600)

高血压是常见病，也是心脑血管病最主要的危险因素。报告显示，中国高血压患者已达2.45亿，每年逾200万人死亡与高血压相关[1]。高血压可导致左室肥厚，继而引起心律失常、心力衰竭和猝死等并发症[2-3]。探索高血压左室肥厚发生机制并寻找其诊疗新方法成为高血压防治的重要举措。

自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)是高血压研究较为理想的实验动物模型，广泛应用于高血压左室肥厚相关研究[4-5]。对于SHR病理生理的实验研究，评价其病理生理状态是实验成功的前提。SHR受饲养环境及代际遗传变异等因素的影响，其病理生理特征可能存在一定差异[6-7]。本研究拟对SHR左室肥厚与血压的动态关系进行动态。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：4周龄SPF级雄性SHR 45只、京都种Wistar大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)35只[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006]，24 h自由饮水和进食，随机分笼饲养42周，于6、8、12、18、24、32和42周共7个时点观测大鼠相关指标。

1.1.2 主要试剂：HE染色剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，Trizol Universal Reagent、FastQuant RT Kit、SuperReal PreMix Plus(北京天根生化科技有限公司)；大鼠ANP、β-MHC和GAPDH引物(深圳华大基因股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血压测量：用北京软隆生物技术有限公司大小鼠智能无创血压计BP-2010A对不同周龄大鼠釆用尾套法测量清醒状态下收缩压[8]。重复测量5次，每次间隔1 min，去除最大和最小值，取余下3次测量数据均值。

1.2.2 心脏结构及功能监测：采用超高分辨率小动物超声成像系统检测左心室射血分数(left ventri-cular ejection fraction,LVEF)、舒张期室间隔厚度(interventricular septal thickness at diastole，IVST)及左心室舒张期末后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole，LVPWT)，分别记录5个心动周期，取各参数平均值[9]。

1.2.3 HE检测心肌组织病理形态：腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g体质量麻醉大鼠，迅速取出心脏,清除心房及右心室游离壁，称重并计算左室质量指数(left ventricular mass index,LVMI)；取7个时点的大鼠左心室组织进行HE染色，测量心肌细胞横径(transverse diameter of myocardial cell,TDM)。显微镜下观察切片并拍照，Image J软件分析处理图片，选择3个高倍视野，再随机选取3个心肌细胞横切面，测量其横径，取平均值。

1.2.4 RT-qPCR检测心肌细胞肥大基因ANP和β-MHC：按试剂说明书依次进行总RNA提取、反转录及qPCR反应。ANP上游引物5′-GGGGGTAG GATTGACAGGAT-3′，下游引物5′-CTCCAGGAGGG TATTCACCA-3′；β-MHC上游引物5′-CCTCGCA ATATCAAGGGAAA-3′，下游引物5′-TACAGGTGCA TCAGCTCCAG-3′；GAPDH上游引物5′-CAAGTTC AACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物5′-ACATACTC AGCACCAGCATCAC-3′。内参为GAPDH，用2-△△Ct计算心肌细胞肥大基因相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠收缩压的动态变化

6至12周SHR收缩压快速上升，12周时较WKY大鼠显著升高(P<0.05)，随后SHR血压呈小幅缓慢上升并维持高位，且与WKY大鼠血压差距持续存在(表1)。

表1 大鼠收缩压动态变化

2.2 心脏结构及功能的动态变化

6周时两组大鼠IVST和LVPWT均相近；12周至32周SHR组IVST较WKY组显著增加且差异持续增大(P<0.05)，32周后两组间IVST差异逐渐回落但仍有显著差异(P<0.05)；8至32周SHR组LVPWT较WKY组明显增加且差异持续增大(P<0.05)，同样32周后两组间LVPWT差异有所减小但仍差异明显(P<0.05)(表2)。

2.3 左心室组织病理形态的改变

SHR组LVMI呈先降后升变化，除8周外，同周龄SHR均显著高于WKY大鼠。6周时两组大鼠TDM相近，8至32周SHR组TDM较WKY组显著增加且差异持续扩大(P<0.05)，32周后差异逐渐缩小但仍存显著差异(P<0.05)(表3，图1)。

2.4 心肌肥厚相关基因ANP和β-MHC表达的变化

6周时ANP表达相近，8周时SHR较WKY大鼠的表达上调(P<0.05)，12周时表达差异缩小，至18周时两组ANP表达出现反转但无显著差异，24周时两组大鼠ANP表达再次反转，SHR较WKY大鼠表达上调(P<0.05)，此后两组间ANP表达差异逐步增大，42周时SHR较WKY大鼠显著上调(P<0.05)(图2)。

表2 大鼠心脏结构和功能的动态变化

表3 大鼠左室病理形态的动态变化

A1.SHR at 6 weeks; B1.SHR at 18 weeks; C1.SHR at 32 weeks; A2.WKY at 6 weeks; B2.WKY at 18 weeks;C2.WKY at 32 weeks

*P<0.05 compared with WKY图2 大鼠左心室组织ANP基因的动态表达Fig 2 Dynamic expression of ANP in left ventricular myocardium of n=5-6)

6周时β-MHC表达相近，8至12周SHR较WKY大鼠明显上调并持续扩大(P<0.05)，12周后两组大鼠β-MHC表达差异持续存在(图3)。

3 讨论

本研究显示， 伴随早期血压快速上升并持续高位波动，心脏后负荷进行性增加，SHR左室出现动态肥厚改变，相关肥厚性指标IVST、LVPWT和LVMI均呈现适应性动态变化。32周后SHR肥厚指标IVST及LVPWT均有所回落，而LVMI从12周开始持续增加至42周，推测与SHR左室肥厚由向心性向离心性转变相关。有报道显示，伴随SHR鼠龄增加，左室肥厚发展至一定阶段可出现萎缩性改变[10-11]。此外，6周时LVMI均处于两组大鼠的高点，推测生长发育期大鼠体质量增长快于左心室质量增加[12]。纵观SHR血压与左室肥厚动态演变，其心脏结构变化略微迟滞于血压改变，符合高血压左室肥厚宏观变化过程。

*P<0.05 compared with WKY图3 大鼠左心室组织β-MHC基因的动态表达Fig 3 Expression of β-MHC in left ventricular myocardium of rats n=5-6)

HE染色显示SHR组TDM与IVST及LVPWT变化趋势一致，再次验证SHR左室肥厚变化中向心性与离心性肥厚的转变。SHR左室心肌ANP表达呈先升后降再升趋势，早期伴随血压急剧上升，ANP表达上调，待血压达峰值并稳定后表达回落，当左室向离心性肥厚转变时表达再次上调。ANP是心脏的自分泌抗肥厚因子，其表达水平因心肌肥厚状态而变化[13]。SHR左室心肌β-MHC表达呈先升后降变化，提示SHR左室肥厚随血压升高经历早期快速发展后持续维持肥厚状态，与SHR左室肥厚相关研究相符[14-15]。由此可见，伴随SHR左室肥厚微观形态的改变，肥厚相关基因表达也呈现出与之相应的动态变化。

通过对SHR中长期的连续观测，证实伴随SHR的血压改变其左室肥厚不断发展，从结构到功能均呈现出特征性动态改变，可为高血压左室肥厚相关研究提供有益参考。