高血压视网膜病变患者外周血单个核细胞Notch1水平及其与血管内皮功能的相关性

游 慧，康海军，陈 方，李 恒

(遂宁市中心医院 眼科, 四川 遂宁 629000)

高血压是中国常见的心血管疾病，其发病人数呈逐年上升趋势，已成为亟待解决的健康难题[1]。高血压会引起全身系统多种器官损伤，视网膜病变是常见高血压继发疾病之一。高血压视网膜病变(hypertensive retinopathy，HRP)无特征性眼部改变，且进展隐匿，不易被发现，虽然其病理表现多为视网膜局部微小动脉硬化和继发改变，但是对中动脉、大动脉病变有提示意义，HRP也被认为与高血压导致心、脑、肾等病变呈正相关[2]。因此，研究HRP中的血管病变机制对该病诊断、治疗具有积极意义。Notch1信号通路参与多种疾病的病理生理调控[3]，研究发现Notch1蛋白通过上下游信号传导可促进新生血管生成、血管硬化[4]，其表达异常可能与心血管疾病、动脉硬化等相关[5]。本研究测定HRP患者单个核细胞中Notch1及血管内皮细胞功能相关因子表达，以期明晰在HRP中Notch1与血管内皮功能病变的可能关系，为HRP血管病变机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择及分组

1.1.1 一般资料：选择2020年1月至2020年9月遂宁市中心医院就诊的HRP患者42例为研究对象(HRP组)，其中男23例，女19例；年龄38～68岁，平均年龄(62.1±7.5)岁，病程2～9年，中位病程5年。诊断标准：参考《中国高血压防治指南2010》[6]中关于HRP的诊断标准进行诊断。纳入标准：1)经过眼科医生专业检查，并符合诊断标准；2)具备完整临床资料；3)无意识障碍，可配合完成相关诊断检查。排除标准：1)合并糖尿病患者；2)其他疾病导致的视网膜病变；3)恶性高血压；4)合并肿瘤患者；5)妊娠期或哺乳期女性。另选择同期遂宁市中心医院体检科行健康体检者30例为对照组，其中男18例，女12例；年龄40～65岁，平均年龄(59.5±6.2)岁。两组患者在一般资料比较中无明显差异，具有可比性。所有研究参与者均知晓本研究目的、过程及意义，签署知情同意书。本研究得到遂宁市中心医院伦理委员会批准，编号：LLSLH20200073。

1.1.2 HRP分期：Ⅰ期：患者视网膜血管尤其是小分支血管变窄、收缩；Ⅱ期：患者视网膜动脉硬化明显，血管存在普遍和局限性缩窄，可出现动静脉交叉征；Ⅲ期：患者眼底出现出血、棉絮样渗出现象，并存在广泛微血管改变；Ⅳ期：在Ⅲ期病变基础上伴视盘水肿和动脉硬化的各种并发症。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：所有入组者取空腹静脉血3～5 mL×2管。其中一管无抗凝剂，于室温下静置约30 min后3 500 r/min离心10 min，收集血清保存于-80 ℃待测。另一管EDTA抗凝，用于提取单个核细胞：ETDA静脉血等体积与0.9%氯化钠溶液混匀，加入5 mL单个核细胞分离液(碧云天生物科技有限公司)，离心30 min，取单个核细胞层以PBS清洗、离心10 min，2～3次，收集细胞，保存于-80 ℃待测。

1.2.2 Notch1的mRNA测定：1)采用RNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取单个核细胞总RNA；2)采用Taq Man反转录试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行cDNA反转录；3)real-time PCR实时荧光定量反应体系：使用TaqTM试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，以β-actin为内参。Notch1引物序列：上游5′-TGCTGAACTGCACT GCTGGTGTACC-3′，下游：5′-ACTGCACTGCTAGCTA CGATTGTGTCAC-3′；β-actin引物序列：上游：5′-GATCATTGCTCCTCTG GAGC-3′ ，下游：5′-CACCTT CACCGTTCCAGTTT-3′。所有操作严格按照说明书进行。Ct表示荧光达到阈值所需要的循环数，以2-△△Ct表示Notch1基因的相对表达量。

1.2.3 血清血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、人内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)测定：血清VEGF、IGF-1、ET-1、NO均采用试剂盒进行测定(碧云天生物科技有限公司)，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 Notch1蛋白的测定：免疫印迹测定Notch1在单个核细胞中表达。选择提取成功的单个核细胞，加入RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)，按照试剂盒说明提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离，然后将蛋白样本转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，兔抗人Notch1单克隆抗体(1∶1 000)(碧云天生物科技有限公司)4 ℃过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶2 000)(碧云天生物科技有限公司)室温孵育1 h。ELC发光液显影，分析实验结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Notch1 mRNA表达水平

HRP组Notch1的mRNA表达明显低于对照组(P<0.01)。HRPⅠ期(12例)、Ⅱ期(10例)患者间无明显差异；但是Ⅲ期(10例)、Ⅳ期(10例)患者呈明显下降趋势(P<0.01)(图1)。

2.2 Notch1蛋白表达

HRP组Notch1的蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)。HRPⅠ期(12例)、Ⅱ期(10例)患者间无明显差异；但是Ⅲ期(10例)、Ⅳ期(10例)患者呈明显下降趋势(P<0.05)(图2)。

2.3 血管新生因子水平、血管内皮细胞功能比较

HRP组VEGF、IGF-1水平显著高于对照组(P<0.05)，且随着分期增加而显著增加(P<0.05)。HRP组ET-1水平显著高于对照组、NO水平显著显著下降(P<0.05)，且随着分期增加ET-1水平显著升高(P<0.05)、NO水平显著下降(P<0.05)(表1，表2)。

2.4 Notch1的mRNA水平相关性分析

HRP组Notch1的mRNA水平与VEGF(r=-0.534，P=0.000)、IGF-1(r=-0.375，P=0.014)、ET-1(r=-0.491，P=0.001)呈显著负相关，与NO呈显著正相关(r=0.413，P=0.006)。

2.5 HRP影响因素分析

以患者是否发生HRP为因变量，以Notch1、VEGF、IGF-1、ET-1及NO为自变量进行Logistic回归分析。结果显示，Notch1、NO低水平是HRP发生的危险因素(P<0.05)，VEGF、IGF-1、ET-1高水平是HRP发生的危险因素(P<0.05)。

3 讨论

Notch1信号通路是人体内高度保守的信号传导机制，能够调节细胞分化、增殖及凋亡[3]。本研究分析HRP患者外周血单个核细胞Notch1表达情况，发现其比对照组明显下降，进一步分析其蛋白水平也得到相似结果，提示Notch1的异常低表达可能参与HRP发病。由于Notch1参与血管生成过程，如血管细胞增殖、分化、迁移及平滑肌细胞分化等， Notch1可能在高血压相关疾病发病过程中起重要作用。有研究[7]证实血管内皮细胞Notch1的减少可能是血管炎性反应和动脉粥样硬化发病的诱因之一。在高血压相关疾病发病过程中，Notch1可能是一种保护性因素[8]。此外，高表达Notch1可明显减轻急性青光眼视网膜受的损伤[9]。本研究结果也证实，随着HRP分期增加，Notch1水平明显下降，这可能与Notch1的保护性作用缺少有关。

*P<0.01 compared with the control group； #P<0.01 compared with phase Ⅰ图1 HRP组与对照组的Notch1mRNA水平Fig 1 Notch1 mRNA levels of HRP group and control group[M(Q25, Q75), n=72]

*P<0.05 compared with the control group； #P<0.05 compared with phase Ⅰ图2 HRP组与对照组的Notch1蛋白水平Fig 2 Notch1 protein levels in HRP group and control n=72)

表1 HRP组与对照组VEGF、IGF-1、ET-1及NO水平比较Table 1 Comparison of VEGF, IGF-1, ET-1 and NO levels between HRP group and control n=72)

表2 HRP组不同分期的VEGF、IGF-1、ET-1及NO水平比较Table 2 Comparison of VEGF, IGF-1, ET-1 and NO levels in HRP group at different n=42)

微血管形成是各种原因致视网膜病变的关键环节，而VEGF、IGF-1都是血管形成不可或缺的因子[10-12]。本研究发现，HRP患者较对照组血清VEGF、IGF-1水平明显升高，并且随着疾病严重程度增加而明显增加；同时，在血管内皮细胞功能比较中也发现HRP患者血清ET-1明显升高、NO明显下降，表明HRP患者血管内皮功能明显衰退，均与其他研究结果[11,13]相符。Kazuya等[14]将Notch1基因敲除小鼠用于构建缺氧诱导的肺动脉高压模型，发现Notch1基因敲除小鼠肺动脉高压明显加重，其机制研究证实此现象可能与血管内皮细胞损伤、血管内皮功能减退有关。在本研究中，Notch1水平与VEGF、IGF-1、ET-1呈显著负相关，与NO呈显著正相关，提示Notch1可能与新生血管形成、血管内皮功能减退有一定关系。进一步的危险因素分析发现Notch1水平低下是HRP发生的危险因素。结合相关研究[8-9,14]，推测可能原因在于：Notch1水平下降，在高血压对视网膜损伤过程发挥的保护性作用减弱，因此导致新生血管形成、血管内皮功能减弱，进而出现视网膜损伤。

综上所述，Notch1水平下降可能与高血压导致的视网膜损伤密切相关，并且是HRP独立危险因素。由于本研究纳入病例较少,未进行多中心研究，因此尚不能判断Notch1对HR是否具有早期诊断价值，还需要进行多中心病例研究，同时开展基础机制研究，以期进一步明确Notch1在HRP发病过程中的作用及对该病的早期诊断价值。