5-羟色胺受体适配子的筛选及其抗抑郁功能

2022-09-27 07:59邵枝定唐晓磊
基础医学与临床 2022年10期
关键词:配子单克隆抗抑郁

邵枝定,高 雪,任 婧,唐晓磊

(皖南医学院第二附属医院 1.神经内科,2.转化医学中心,安徽 芜湖 241000)

抑郁症(depression)是一种发病率较高的神经精神疾病,可发病于各个年龄段[1]。重度抑郁症和相关抑郁症的病因复杂,目前还不完全了解[2-3]。抑郁症的病因有多种假说,目前最广泛的抑郁症假说与细胞外神经递质水平有关,如去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、g-氨基丁酸(GABA)及5-羟色胺(5-HT)等[4-6]。因此提高单胺水平的物质可能有益于抑郁症的治疗[7]。在单胺类再摄取抑制剂中,选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin re-uptake inhibitors, SSRIs)已被列为一类最有效的物质。SSRIs的作用机制是抑制SERT,使5-HT的突触水平提高[8]。升高的5-HT浓度会激活大脑多个区域的各种突触后5-HT受体,可以减轻抑郁症[9]。此外,细胞外高浓度的5-HT触发了涉及5-HT1A自受体的负反馈机制,该机制调节突触间隙中的5-HT水平。高浓度内源性的5-HT可能足以抑制乙酰胆碱受体[10]。

抗抑郁药物应用多会存在一些不良反应[11]。用药早期个别患者会出现头晕、头疼、恶心、转氨酶升高等反应。因此需要定期监测生化指标,及时发现问题并且进行改善。鉴于目前治疗药物的不足,以及指数富集的配基系统进化技术(systematic evolu-tion of ligands by exponential enrichment, SELEX)在医药领域的应用前景[12-13],本研究拟克隆表达5-羟色胺1A型受体(5-hydroxytryptamine 1A receptor, 5-HT1AR)作为靶标,运用该技术筛选能够特异性结合5-HTR的适配子制剂,并利用其封闭阻断5-HT的再摄取,以此发挥抗抑郁功效。

1 材料与方法

1.1 材料

8周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠(体质量:18~20 g)[南京青龙山动物实验基地,动物合格证号:SCXK(豫)2020-0005];小鼠骨骼肌肌肉母细胞系C3H(上海基尔顿生物公司);反转录试剂盒(Fermentas公司);引物由上海生工公司合成;His标签纯化柱子、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(索莱宝公司);预染蛋白Marker(赛默飞公司);异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thioga-lactoside, IPTG)(Sigma-Aldrich公司);HRP耦连的小鼠抗His标签单克隆抗体(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.15-HT1AR的克隆构建:取C57BL/6J小鼠肌肉组织,匀浆后使用Trizol法提取小鼠RNA,并通过反转录试剂盒转化为cDNA,应用https://www.uniprot.org/uniprot/Q64264根据NCBI(NM_008308)设计引物:正向5′-CGGATCCGATATGTTC AGTCTTGGCCAG-3′(下划线标记为BamHⅠ限制性酶切位点); 反向5′-CAAGCTTGGCGGCAGAA CTTG CACTTG-3′(下划线标记为HindⅢ限制性酶切位点);将PCR产物使用限制性内切酶酶切后与质粒pET28a连接,转化入DH5ɑ工程菌,使用卡那霉素抗性LB固体培养基筛选;挑取阳性单克隆菌落,扩增细菌提取质粒后酶切鉴定。

1.2.2 5-HT1AR蛋白表达、纯化及鉴定:将pET28a/5-HT1AR转化入BL21菌株,配制浓度为0.8 mol/L IPTG,按体积比1∶1 000加入菌液中,于25 ℃经4 h诱导表达;培养结束后离心收集细菌,经高压均质仪裂解细菌,4 ℃ 10 000×g离心30 min, 收集上清加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF);通过Ni-NAT纯化重组5-HT1AR蛋白,并利用小鼠抗His标签单克隆抗体行Western blot鉴定,同时行肽指纹图谱鉴定。

1.2.3 5-HT1AR蛋白适配子的筛选:设计合成适配子文库[13]:5′-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATA GGGAACAGTCCGAGCC-(N30)-GGGTCAATGCGTC ATA-3′(88 nt,其中N代表A、T、G、C任意一个碱基);同时设计引物:P1:5′-GCGGAATTCTAATACG ACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3′;P2:5′-G CGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3′;将纯化的5-HT1AR蛋白使用pH 9.6碳酸盐缓冲液溶解,调节至浓度为10、1、0.1和0.01 mg/L,50 μL/孔包被于聚苯乙烯微孔,每3轮使用1个浓度,共经过12轮正向筛选;于第6轮至第10轮加入5轮反向筛选;并比较每一轮文库的相对结合力大小。

1.2.4 单克隆适配子的筛选及结合力的检测:将1.2.2中相对结合力最高的适配子文库经PCR扩增为双链DNA,并经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到pUC19质粒上,转化,培养;挑取单克隆菌落提取质粒,酶切鉴定后,通过不对称PCR扩增ssDNA适配子,并通过酶联寡聚核苷酸吸附试验法(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)检测其相对结合力。筛选相对结合力较高的适配子进行测序,同时通过竞争法验证其识别位点的一致性:生物素标记的适配子与非标记的适配子放入5-HT1AR预包被的微孔中,孵育后洗涤,加入链霉亲和素标记的HRP,孵育后洗涤,通过显色底物检测450 nm吸光度。

1.2.5 检测单克隆适配子的特异性:合成1.2.3中筛选获得的相对结合力最高的单克隆适配子,其5′端使用FAM标记,以不同浓度(0、10、20、40和80 mmol/L)适配子分别与小鼠骨骼肌细胞系C3H避光共孵育45 min,PBS洗涤后,通过流式细胞术观察比较其结合力。

1.2.6 适配子阻断5-HT摄取的检测: 使用Angilent1260高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测终浓度500 mg/L 5-HT标准品、C3H细胞培养中起始加入200 mg/L 5-HT、C3H细胞培养中起始加入200 mg/L 5-HT和适配子10 nmol孵育12 h后培养基内5-HT浓度、C3H细胞培养中起始加入200 ng/mL 5-HT孵育12 h后培养基内5-HT浓度;12 h后,细胞均经过1 000×g离心15 min收集上清。

1.2.7 小鼠悬尾实验评估适配子的治疗效果:将小鼠悬尾实验箱内分为3组:对照组:悬挂6 min,观察后4 min内小鼠静止的时间;适配子治疗组:通过尾静脉注射适配子后,悬挂尾部6 min,观察后4 min内小鼠静止的时间;试剂对照组:尾静脉注射0.9%氯化钠溶液;药物治疗组:口服20 mg/kg氟西汀;同样观察4 min内小鼠静止的时间。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 pET28a/5-HT1AR表达质粒的构建与鉴定

琼脂糖电泳显示,在1 000 bp和2 000 bp之间有一条条带,与预期PCR扩增目的条带产物1 272 bp大小一致(图1);pET28a/5-HT1AR质粒双酶切的琼脂糖电泳分析,产生两个条带,分别为5 kp和1.27 kp,与预期目标产物一致(图1);将阳性单克隆菌落提取的质粒送上海生工公司测序,其结果与GenBank(NM_000524)一致。

M.DNA ladder; 1.5-HT1AR; 2.double enzymedigestion of pET28a/5-HT1AR图1 pET28a/5-HT1AR表达质粒的鉴定Fig 1 Identification of expression plasmid pET28a/5-HT1AR

2.2 5-HT1AR表达及纯化

pET28a/5-HT1AR质粒表达的重组5-HT1AR蛋白在40~55 ku有显著表达条带,与预测分子质量47 ku符合(图2)。经肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF) 鉴定分析,其与5-HT1AR肽段序列一致(表1)。

2.3 适配子筛选及鉴定

经过12轮的正向筛选和5轮反向筛选后,将结合力最高的第12轮适配子文库克隆至pUC19质粒进行筛选(图3),共选取51例阳性克隆,其中18号克隆、25号克隆、31号克隆和45号克隆分别表现出较高的结合力(图4~6);同时对上述4条ssDNA碱基序列进行特异性分析,结果显示,其具有高度的同源性(表2),经Mfold软件分析及ELONA鉴定,4个适配子可能识别相同表位(图7);流式细胞检测分析18号适配子与小鼠骨骼肌肌肉母细胞系C3H显示出较高的结合力,且呈一定的剂量依赖性(图8);随后通过HPLC检测5-HT标准品,其保留时间为4.8 min,将培养体系中加入200 m/L 5-HT,对加入18号适配子和不加入适配子12 h后的检测,根据峰面积计算可知,加入适配子能够有效地降低系统内5-HT浓度(图9)。

M.protein ladder; 1.purified recombinant human 5-HT1AR protein; 2.uninduced pET28a/5-HT1AR recombinant plasmid; 3.IPTG-induced pET28a/5-HT1AR recombinant plasmid; arrow.recombinant 5-HT1AR protein (molecular weight: 47 ku)图2 SDS-PAGE鉴定诱导表达重组5-HT1AR蛋白Fig 2 Identification of induced expression of recom-binant 5-HT1AR by SDS-PAGE

表1 肽指纹图谱鉴定重组5-HT1AR蛋白

Horizontal coordinates: 1 to 12 represent round 1 to round 12 libraries, and L represents the initial library; *P<0.05 compared with the 2nd to 12th library图3 不同文库的相对结合力的比较Fig 3 Comparison of relative binding force among different pools

表2 4种相对高结合力的适配子序列同源性分析

2.4 小鼠悬尾模型验证其抗抑郁功效

80 nmol/L的 18号适配子注射组其悬尾摆动时间远高于未处理模型组、0.9%氯化钠溶液对照模型组(P<0.05)(图10)。

3 讨论

早期三环类和现今的SSRIs类药物抗抑郁药物在治疗抑郁中发挥重要作用,临床观察发现它们对心血管的不良反应同样不容忽视[11,14]。基于这些抑郁症治疗药物的诸多不足,本研究拟根据SSRIs的药理机制设计一种能够特异性结合5-HT1AR的配基,其通过特异性的空间构象与5-HT1AR结合后阻断对5-HT1的摄取,从而保持5-HT的浓度,达到抗抑郁的功效。5-HT相关受体种类较多,其中5-HT1AR与抑郁症的相关性研究较多,且机制较为清晰[15]。

Arrow: aptamer double-stranded DNA amplified by PCR from 18 randomly selected monoclonal colonies (88 nt)图4 PCR鉴定阳性克隆Fig 4 Identification of positive clones by PCR

Arrow: monoclonal aptamers with high relative binding force (No.18, 25, 31 and 45)图5 不同单克隆适配子相对结合力的比较Fig 5 Comparison of relative binding force among different monoclonal aptamers

图6 4种单克隆适配子的亲和力的测定Fig 6 Detection of binding force from four monoclonal aptamers

Bio.adding biotin-labeled aptamers;*P<0.05 compared with different groups图7 4种单克隆适配子结合位点一致性的验证Fig 7 Verification of binding site consistency among four aptamers

图8 流式细胞检测术分析18号适配子对C3H细胞的结合Fig 8 Analysis of binding force between aptamer 18 and C3H cell line by flow cytometry

A.5-HT standard substance; B.concentration of 5-HT adding into culture system; C.concentration of 5-HT adding into culture system with aptamer 18 blocking after 12 hours; D.concentration of 5-HT adding into culture system without treatment after 12 hours; E.comparison concentration of 5-HT adding into culture system with aptamer 18 treatment before and after 12 hours; *P<0.05 compared with group without treatment; #P<0.05 compared with group before treatment

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank control group without treatment;#P<0.05,##P<0.01 compared with model group without treatment图10 小鼠悬尾试验中不同处理组的小鼠摆动时间Fig 10 Exercise time of different treatment in tail suspension test

因此本研究通过克隆表达5-HT1AR作为靶标,利用SELEX技术筛选获得与之高亲和力的核酸适配子,并利用适配子干预5-HT的重摄取。目前核酸适配子筛选已广泛应用至制药、检测、抗感染等领域。其由于自身的分子质量较小、靶标范围广、免疫原性低、结构稳定、易于修饰等特性而备受关注[12-13]。本研究成功构建表达了5-HT1AR蛋白, 并通过SELEX技术筛选获得了两个具有较高特异性高结合力的适配子。因此该筛选获得的适配子可以封闭5-HT1AR,发挥抗抑郁的作用。体外实验显示,适配子能够影响体系内5-HT的浓度,但是经过一段时间的培养后其浓度显著下降,考虑可能为其他受体对5-HT的结合所致。本研究仅针对5-HT1AR进行筛选并干预,还不能完全影响5-HT浓度。

本研究动物悬尾实验中,适配子注射组小鼠的活动时间远超出对照组(模型组、0.9%氯化钠溶液组),其与药物治疗组数据相当。这一结果显示本次筛选获得的适配子具有一定的抗抑郁功效。然而,在本次研究过程中发现,适配子的高剂量注射引起了小鼠的持续肌肉紧张,推测可能因为适配子阻断5-HT的摄取,导致大量5-HT的积累引发的高频兴奋所致。适配子结合5-HT1AR不仅作用于中枢神经系统,其对有相同结构的其他部位的5-HT1AR均具有高结合力。目前,根据适配子的一些自组装的特异性能,设计能够更精准识别人中枢神经系统的5-HT1AR的核酸适配子,以期获得精准的适配子定位。

综上所述,本研究初步实现了通过SELEX技术获得5-HT1AR的核酸配基,并通过体外实验和动物实验验证了这一实验的可行性以及治疗效果。其同时也为小分子阻断型生物制剂的研究提供新思路。

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