rL-RVG抑制人小细胞肺癌细胞系NCI-H446的增殖及迁移

梁 冰，严玉兰

(1.昆山市中医医院 呼吸科，江苏 昆山 215300； 2.江苏大学附属人民医院 呼吸科，江苏 镇江 212000)

小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是恶性程度较高的恶性肿瘤之一，虽然目前免疫治疗对其部分有效，但很多患者因经济原因或其不良反应而无法耐受免疫治疗。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是最常见且最具潜力的溶瘤病毒之一[1]。NDV可以选择性地杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞，因它在癌细胞中复制效率是正常细胞的10 000倍[2]。前期实验研究发现重组新城疫病毒rL-RVG[3]能够抑制肺腺癌细胞系A549的增殖，并有促凋亡作用[4]，而且rL-RVG能够影响A549细胞系的迁移及活动减弱[5]，但rL-RVG对人小细胞肺癌细胞系NCI-H446的作用机制不详，本实验主要探讨rL-RVG对SCLC细胞增殖及迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

NDV LaSota系、rL-RVG(哈尔滨兽医研究所)；人小细胞肺癌细胞系NCI-H446(上海生命科学研究院细胞库)；胎牛血清、DMEM细胞培养基(维森特生物技术有限公司)；HRP-兔抗鸡二抗(Earthox公司)；FITC-山羊抗鼠二抗、Cy3-山羊抗鸡二抗(康为世纪生物科技股份有限公司)；兔抗E-cadherin、兔抗MMP2 抗体(博士德生物工程有限公司)；核荧光染料(Hoechst33342)、MTT(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光法检测病毒蛋白的表达：将NCI-H446细胞接种在高温灭菌后的盖玻片上，将盖玻片放入24孔细胞培养皿中培养，加入稀释好的rL-RVG及NDV病毒液，恒温箱过夜，洗涤，固定，再洗涤，封闭，加入鸡抗NDV(1∶150)一抗或小鼠抗狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)(1∶100)一抗，加入Cy3-山羊抗鸡(1∶300)二抗或FITC-山羊抗鼠(1∶100)二抗，细胞核用0.2 μmol/L Hoechst 33342作用30 min，封片。于荧光显微镜下观察细胞中的标志物：FITC(绿色)、Cy3(红色)和Hoechst 33342(蓝色)。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖：rL-RVG及NDV病毒液的滴度在鸡胚半数感染量为109.8EID50/mL[3-5]。将rL-RVG和NDV用DMEM培养基(不含血清)稀释至10-1、10-2、10-3和10-4浓度，将增殖期的NCI-H446细胞接种在96孔细胞培养皿，100 μL/孔，在rL-RVG组及NDV组分别加入相应的病毒稀释液，PBS组为阴性对照组[4]，详细过程见参考文献[5]。重复实验3次。计算细胞增殖抑制率[4-5]：细胞活力值=(实验组平均A值/空白对照组平均A值) ×100%。

1.2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移能力：根据参考文献[5]中方法进行细胞处理，用无菌200 μL枪头在细胞层中纵向划线，将PBS、NDV(10-3稀释度)、rL-RVG(10-3稀释度)分别感染细胞24 h，光镜下观察划痕宽度。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞迁移能力：在24孔板的Transwell上室内每孔加入100 μL增殖期NCI-H446细胞悬液，下室分别加入含rL-RVG(10-3稀释度)、NDV(10-3稀释度)的DMEM液600 μL，对照组加入DMEM液600 μL，37 ℃培养1 d，擦去Transwell上室聚碳酸酯膜表面的细胞，冲洗后用4%多聚甲醛固定上室细胞15 min，再次冲洗后用结晶紫染色20 min，选取5个不同视野，在倒置荧光显微镜下(×200)计数穿膜细胞，求平均值。

1.2.5 免疫荧光法检测迁移途径：按照1.2.1实验步骤处理rL-RVG组、NDV组和对照组，后加入E-cadherin、MMP2一抗及对应的二抗，加核荧光抗体后在荧光显微镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RVG及NDV蛋白在细胞内的表达

在荧光显微镜下可见，RVG蛋白及NDV蛋白均可在细胞中稳定表达，NDV荧光蛋白表达量在rL-RVG组较NDV组多(图1)。

图1 rL-RVG和NDV感染NCI-H446细胞24 h后RVG蛋白及NDV蛋白的表达

2.2 rL-RVG对细胞增殖的影响

rL-RVG病毒液及NDV病毒液被稀释成不同浓度，rL-RVG和NDV均对细胞的增殖有一定的抑制作用；病毒浓度越高，对癌细胞的抑制作用越强；rL-RVG对小细胞肺癌细胞的抑制效果强于NDV(P<0.05)(图2)。

*P< 0.05 compared with NDV group图2 不同浓度的rL-RVG和NDV对NCI-H446细胞增殖的影响Fig 2 Effect of rL-RVG and NDV at different solubilities on cell proliferation of NCI-H446

2.3 rL-RVG对细胞迁移能力的影响

rL-RVG、NDV及PBS感染细胞划痕后24 h，细胞的迁移距离分别为(465±40)μm、(739±7)μm及(1 505±13)μm，rL-RVG组细胞迁移距离显著小于NDV组及对照组(P<0.05)(图3)。

rL-RVG组及NDV组穿过小室的细胞数明显少于对照组(P<0.05)(图4)。

相较于对照组及NDV组，MMP2的荧光强度在rL-RVG组中减弱(P<0.05)，而E-cadherin 荧光强度升高(P<0.05)(图5)。

3 讨论

小细胞肺癌的侵袭与转移是其治疗失败的原因之一，严重影响患者的治疗效果。新城疫病毒(NDV)隶属禽副黏病毒属，是一种主要感染禽类的鸡瘟病毒[1]。根据NDV在禽类中的致病性，可以被分为3个主要致病型：低毒株、中毒株和强毒株， 其中NDV LoSata系是低毒株， 亦是本实验选其的原因之一。有临床试验表明NDV野生株在各种实体肿瘤治疗中未见明显的不良反应[6]，rL-RVG具有安全、高免疫活性、稳定表达的特点[3]。本实验结果显示，rL-RVG能在NCI-H446细胞中稳定表达，抑制细胞增殖，并且NDV荧光蛋白表达量在rL-RVG组中较NDV LaSota组多。在划痕实验及Transwell小室法中，rL-RVG明显抑制NCI-H446细胞的迁移，较NDV作用强。细胞迁移是恶性肿瘤侵袭和迁移的关键步骤之一[5,7]，上皮细胞间质转化与癌细胞的侵袭和转移关系密切[5,8]。参与上皮细胞间质转化的重要调控因子有MMP2和E-cadherin。MMP2在细胞外基质的合成、降解过程中发挥重要作用，其降解细胞外基质的功能是肿瘤细胞侵袭和转移的基础，与肿瘤上皮细胞间质转化的发生密切相关[9-10]。MMP2在SCLC中表达较高[11]。E-cadherin是一种钙依赖性的跨膜蛋白，参与细胞与细胞间黏附，可以激活钙黏蛋白，促进桥粒连接形成，能够参与维持细胞的极性和完整性[5,8]。上皮细胞间质转化的产生与E-cadherin的异常表达直接相关，在癌侵袭中起着重要作用[5]。本研究发现，rL-RVG感染NCI-H446后影响MMP2及E-cadherin的表达，从而抑制小细胞肺癌细胞的迁移。

图3 划痕实验检测rL-RVG和NDV对NCI-H446细胞迁移的影响Fig 3 Effect of rL-RVG and NDV on migration of NCI-H446 cells detected by scratch test(×40)

arrow pointed to NCI-H446 cells; *P< 0.05 compared with control group

A:immunofluorescence analysis of MMP2 and E-cadherin protein expression: a-c.MMP2 of PBS，NDV and rL-RVG group，respectively, d-f.E-cadherin of PBS，NDV and rL-RVG group，respectively; B:single cell fluorsence intensity of MMP2, *P<0. 05 compared with control and NDV group; C:single cell fluorsence intensity of E-cadherin,*P<0. 05 compared with control and NDV group