LncRNA-ATB抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和胶原合成

吕 雄，仇灵江，劳洵姬，谈伟强

(1.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 整形外科，浙江 杭州 310020；2.温州医科大学附属衢州医院(衢州市人民医院)医疗美容科， 浙江 衢州 324000；3.浙江省台州医院 整形美容科，浙江 台州 317099)

瘢痕疙瘩(keloid，KD)是一种良性皮肤纤维增生性肿瘤，通常是易感个体伤口异常愈合的结果，为人类独有[1]。KD可进行性生长，不断侵蚀周边正常组织，其特征为成纤维细胞(fibroblasts，FB)的过度增殖和胶原纤维的异常沉积[2]。长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)与人类多种疾病进展密切相关。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号异常高活化与KD的发生和发展有关，下调转化生长因子β激活的lncRNA(lncRNA activated by transforming growth factor-β，lncRNA-ATB)可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts，KFB)中TGF-β2的自分泌[3]。但lncRNA-ATB在KFB增殖和胶原合成中的作用还尚未可知。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路涉及转移、发育和凋亡等生物过程[4]。阿司匹林可有效抑制KFB中的NF-κB信号通路活化来诱导细胞凋亡[5]。这表明NF-κB信号通路在KD中可能发挥重要作用。本实验旨在研究lncRNA-ATB在KD中的作用以及其是否可通过调控NF-κB信号通路而影响KFB的增殖和胶原合成。

1 材料与方法

1.1 材料

杜氏改良依格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)培养基(Hyclone公司)；胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)；Trizol试剂及反转录和荧光定量试剂盒(TaKaRa公司)；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay， RIPA)蛋白裂解液及二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；si-NC及si-lncRNA-ATB(上海吉玛制药公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)、p-p65和p-IκBα抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:KFB和人正常成纤维细胞(NFB)从浙江大学医学院手术切除的KD中和健康人皮肤组织中收集。本研究已获得单位伦理委员会批准及参与者知情同意。按照实验方法[6]分离细胞，使用75%乙醇溶液浸泡后，经过PBS冲洗3次，除去血管、皮肤表层等结缔组织，在无菌条件下剪碎组织块1 mm3，加入IV胶原酶试剂，1 200 r/min离心 5 min后弃上清，加DMEM培养基反复吹打，再次离心，PBS冲洗3次，于DMEM培养基中以37 ℃、5% CO2环境条件培养，每周换液2～3次，在细胞汇合度至70%时进行传代。倒置显微镜下观察细胞增生情况，取第5代细胞用于后续实验。

将si-NC和si-lncRNA-ATB分别转染至si-NC组和si-lncRNA-ATB组，未经转染的KFB为NC组。si-lncRNA-ATB+TNF-α组以TNF-α(20 ng/mL的NF-κB活化激活剂)处理转染si-lncRNA-ATB的KFB。转染按照Lipofectamine2000试剂盒说明进行。

1.2.2 RT-qPCR检测lncRNA-ATB表达水平:提取各组KFB总RNA，反转录为cDNA，lncRNA-ATB以β-actin为内参，相对表达量采用2-△△Ct法计算。lncRNA-ATB上游引物序列：5′-TGGGATTCGATCAA CAGAGAGT-3′，下游引物序列：5′-CATACTGCCC CTCCCGTTTG-3′；β-actin上游引物序列：5′-CATGT ACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物序列：5′-CTCC TTAATGTCACGCACGAT-3′；引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.2.3 MTT法检测细胞活力:将各组KFB(2×105个/mL)接种于96孔板(100 μL/孔)，培养24 h，加入MTT溶液(20 μL/孔)，室温孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(150 μL/孔)，室温振荡孵育5 min，酶标仪检测490 nm处的吸光度(A值)，即代表细胞活性。

1.2.4 Western blot检测cyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-p65和p-IκBα蛋白的表达水平：提取各组KFB总蛋白，用BCA试剂盒定量。各组蛋白上样量60 μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭，一抗4 ℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，二抗室温孵育2 h，PBS洗涤3次，暗室中曝光显影，定影。Image J软件分析目的蛋白条带灰度值，目的蛋白表达量以其与内参β-actin的灰度值比值表示。

1.2.5 流式细胞测量术检测细胞周期:取对数增生期第3～6代细胞制成细胞悬液，以流式细胞仪检测细胞周期分布，每个样本重复5次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人KFB中lncRNA-ATB的表达

与NFB(1.00±0.11)比较，KFB中lncRNA-ATB表达水平(2.38±0.21)升高(P<0.05)。

2.2 敲减lncRNA-ATB表达对KFB增殖的影响

与NC组比较，si-NC组lncRNA-ATB和cyclinD1表达水平、KFB细胞增殖以及G0/G1、S和G2期细胞百分比无显著差异。与si-NC组比较，si-lncRNA-ATB组LncRNA-ATB表达水平显著降低，cyclinD1表达水平、KFB细胞活力以及S期细胞百分比显著降低，G0/G1期细胞百分比升高(P<0.05)(图1,表1)。

2.3 敲减lncRNA-ATB表达对KFB胶原合成的影响

与NC组比较，si-NC组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达水平无显著差异。与si-NC组比较，si-lncRNA-ATB组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达水平显著降低(P<0.05)(图2, 表2)。

A.cell cycle changes were detected by flow cytometry; B.expression of cyclinD1 protein was detected by Western blot图1 敲减lncRNA-ATB表达抑制KFB周期进程以及相关蛋白的表达Fig 1 Knock-down of lncRNA-ATB expression inhibits KFB cycle progression and related protein expression

表1 敲减lncRNA-ATB表达抑制KFB的增殖及cyclinD1蛋白表达Table 1 Knock-down lncRNA-ATB expression inhibits KFB proliferation and cyclinD1 protein

图2 Western blot检测Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表达Fig 2 The expression of Col-Ⅰ and Col-Ⅲ proteins by Western blot

表2 敲减lncRNA-ATB表达抑制KFB的胶原合成

2.4 敲减lncRNA-ATB表达对人KFB中NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与NC组比较，si-NC组p-p65、p-IκBα表达水平无显著差异。与si-NC组比较，si-lncRNA-ATB组p-p65、p-IκBα表达水平显著降低(P<0.05)(图3, 表3)。

2.5 TNF-α可减弱si-lncRNA-ATB对KFB增殖和胶原合成的抑制作用

与si-lncRNA-ATB组比较，si-lncRNA-ATB+TNF-α组p-p65、p-IκBα、cyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达水平、KFB细胞A值以及S期细胞百分比显著升高，G0/G1期细胞百分比显著降低(P<0.05)(图4,表4)。

图3 Western blot检测p-p65和p-IκBα蛋白的表达Fig 3 The expression of p-p65 and p-IκBα proteins detected by Western blot

表3 敲减lncRNA-ATB表达对人KFB中NF-κB信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

KD来源的FB是KD组织的主要细胞成分，在调节细胞外基质如Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的合成和重塑中发挥关键作用，表明持续的侵袭性增生与胶原生成之间存在关联[7]。由于KD的临床表现以及病理学特征与肿瘤相似，因此，众多研究将肿瘤的研究结果应用于KD的治疗[8]。有研究报道lncRNA-ATB在人类多种癌中表达异常，可促进癌的发生发展。lncRNA-ATB在卵巢癌组织中表达升高，其高表达与患者的不良预后相关；沉默lncRNA-ATB表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、 侵袭和迁移[9]。LncRNA-ATB在喉癌组织中表达增强，并与T分级和临床分期有关，lncRNA-ATB高表达的总生存率明显降低[10]。过表达lncRNA-ATB可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[11]。沉默lncRNA-ATB表达可抑制胆管癌细胞活力，诱导细胞凋亡和G0/G1期阻滞[12]。与上述研究结果一致，本研究结果显示，与NFB比较，KFB中lncRNA-ATB表达水平升高，敲减lncRNA-ATB表达降低了KFB细胞活力、cyclinD1水平以及S期细胞百分比，升高了G0/G1期细胞百分比；降低了Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平。这表明，下调lncRNA-ATB表达可抑制KFB的增殖和胶原合成。

A.cell cycle changes were detected by flow cytometry; B.the expression of cyclinD1 protein was detected by Western blot图4 TNF-α可减弱si-lncRNA-ATB对KFB周期和相关蛋白表达的影响Fig 4 TNF-α attenuates and reverses the effects of si-lncRNA-ATB on KFB cycle and related protein expression

表4 TNF-α可减弱si-lncRNA-ATB对KFB增殖、相关蛋白表达和胶原合成的抑制作用

研究发现，NF-κB信号通路在癌中异常激活。NF-κB在结肠癌细胞系中上调，下调NF-κB可减弱过表达lncRNA 癌症易感性候选物2(cancer susceptibility candidate 2，CASC2)对结肠癌细胞活力的抑制作用[13]。过表达核因子NF-κB相关lncRNA [nuclear factor (NF)-κB-related lncRNA，lncRNAN KILA]可抑制宫颈癌CaSki细胞中NF-κB的激活，从而抑制CaSki细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化[14]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，敲减lncRNA-ATB表达降低了NF-κB信号通路相关蛋白p-p65和p-IκBα的水平；进一步研究结果显示，NF-κB活化激活剂TNF-α可减弱敲减lncRNA-ATB表达对KFB增殖和胶原合成的抑制作用，KFB细胞中p-p65和p-IκBα水平增加，KFB细胞活力、cyclinD1水平以及S期细胞百分比升高，G0/G1期细胞百分比降低，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达升高。这表明lncRNA-ATB可通过调控NF-κB信号通路影响KFB的增殖和胶原合成。

综上所述，lncRNA-ATB在KFB中表达上调，敲减lncRNA-ATB表达可能通过下调NF-κB信号通路抑制KFB的增殖和胶原合成,lncRNA-ATB可能是KD的潜在治疗靶点。