鱼皮胶原肽的制备及其品质分析

王 霞, 毕桂灿, 赖园园

（1.广东食品药品职业学院生物技术学院, 广东 广州 510000；2.华南农业大学生物质工程研究院, 广东广州 510000；3.安徽国肽生物科技有限公司, 安徽 宣城 242000）

胶原蛋白是由3条肽链组成的螺旋纤维状蛋白质[1], 其空间结构复杂, 分子量约为300 kD, 很难被机体直接吸收[2]。通过水解将胶原蛋白分解为胶原肽, 而相对分子量的大小是影响胶原肽吸收的重要因素。研究表明, 分子量为5 kD和3 kD的胶原肽具有良好的抗氧化、抗衰老和降血压等生理活性[3]。胶原蛋白的氨基酸排列具有周期性特点, 以三肽结构Gly-X-Y为单位重复排列[4]。其中, 羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸, 功能是维持胶原三股螺旋的稳定性[5]。随着对胶原肽品质要求的提高, 其外观颜色、气味、水分含量、污染物含量、分子量的分布、羟脯氨酸含量等成为评价胶原肽品质的重要项目。以罗非鱼皮为原料, 通过酶解、微滤和超滤等工艺流程制备胶原肽, 以GB 31645—2018《胶原蛋白肽》为依据, 对胶原肽进行理化指标评价, 并对其相对分子质量分布和羟脯氨酸含量进行测定, 为酶解鱼皮制备胶原肽的工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SCAU胶原蛋白酶和鱼皮, 华南农业大学生物质工程研究所提供；NaOH（分析纯）, 无锡晶科化工提供；HCl（分析纯）, 永飞化学试剂提供；活性炭（食品级）, 湖北兴恒业提供；羟脯氨酸含量检测试剂盒, 北京索莱宝提供。

1.2 仪器与设备

BKQ-B75L型自动蒸汽灭菌锅, 博科高压产品；FA1204型电子天平, 上海邦亿产品；1810D型自动双重纯水蒸馏器, 上海华岩产品；HH-4型恒温水浴锅, 江苏科宏产品；Millipore Pellicon XL超滤膜包5 kDa, 德国密理博产品；ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷冻干燥机, 德国Marin Christ产品；MALDI-TOF型基质辅助激光解析飞行时间质谱, 德国Bruker Daltonics产品；戴安ICS-900型离子色谱仪, 美国产品。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼皮胶原肽的提取

鱼皮洗净, 刮去鱼皮表面鱼鳞和脂肪, 剪成小块, 称取10 g鱼皮, 于121℃下高压灭菌15 min, 按料液比1∶4（g∶mL）加入无菌水, 调节pH值, 加入SCAU胶原蛋白酶液, 水浴锅中水解数小时后, 加入0.3 g活性炭粉于沸水浴中保温5 min终止酶解, 冷却至室温, 抽滤得酶解液, 将酶解液冷冻干燥后得胶原肽粉, 计算胶原肽的提取率, 计算公式如下：

1.3.2 提取条件的优化

反应条件根据单因素试验结果进行调整, 选择加酶量、酶解时间、酶解温度、pH值为因素, 通过四因素三水平L9（34）正交试验确定最佳酶解条件。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3.3 胶原肽的分离

在最优条件下酶解鱼皮, 酶解液经过φ0.22μm微孔滤膜过滤和截流分子量为5000 Da的超滤膜过滤。滤液经冷冻干燥后得胶原肽粉, 冷冻干燥的温度为-50℃, 压强为0.37 mbar, 时间为48 h。

1.3.4 胶原肽理化指标和污染物限量的测定

胶原肽粉总氮含量的测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》, 灰分含量的测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》, 水分含量的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》。铅、镉、总砷、铬、总汞含量的由华南理工大学测试中心经戴安ICS-900型离子色谱仪检测。

1.3.5 胶原肽相对分子量分布

胶原肽相对分子量分布由中山大学测试中心经基质辅助激光解析飞行时间质谱完成, 采集范围为＜10000 Da。

1.3.6 胶原肽羟脯氨酸含量测定

参考羟脯氨酸含量检测试剂盒说明书进行调整。称取10 mg胶原肽粉, 加入6 mol/L盐酸溶液5 mL溶解, 于110℃下水解6 h, 用浓度10 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0, 蒸馏水定容至16 mL, 取上清液为样品液, 测定时稀释10倍使用。

将试剂盒中的羟脯氨酸标准品（0.5 mg/mL）稀释成质量浓度为15.000, 7.500, 3.750, 1.875, 0.938, 0.469, 0.234, 0.117μg/mL的标准溶液。取各质量浓度标准溶液、样品液和蒸馏水（空白）各200μL, 加入试剂盒中试剂一200μL, 混匀, 室温静置20 min。再分别加入试剂二200μL、蒸馏水400μL, 混匀, 于60℃水浴20 min, 室温静置15 min。以空白管调零, 于波长560 nm处测定各管吸光度, 绘制标准曲线并计算样品中羟脯氨酸含量, 计算公式如下：

式中：X——测定所得羟脯氨酸质量浓度, μg/mL；

V样——样品管中所含样品体积, 0.2 mL；

N——稀释倍数, 800；

W——样品质量, 10 mg。

2 结果与分析

2.1 胶原肽提取单因素试验

（1）加酶量对提取率的影响。

加酶量对鱼皮胶原肽提取率的影响见图1。

图1 加酶量对鱼皮胶原肽提取率的影响

由图1可知, 胶原肽提取率随酶液加入量的增加而增加, 当酶液加入量为2.0 mL时提取率最高, 之后略有下降, 说明适当的酶浓度有利于胶原肽的提取。因此, 选择1.5, 2.0, 2.5 mL作为正交水平。

（2）酶解时间对提取率的影响

酶解时间对鱼皮胶原肽提取率的影响见图2。

由图2可知, 随着酶解时间的延长, 提取率逐渐增加, 至5 h时达到最高, 再延长酶解时间, 提取率变化不大, 可能是因为长时间保温对酶活性有一定影响。因此, 选择4, 5, 6 h作为正交水平。

图2 酶解时间对鱼皮胶原肽提取率的影响

（3）酶解温度对提取率的影响。

酶解温度对鱼皮胶原肽提取率的影响见图3。

由图3可知, 随着酶解温度的提高, 鱼皮胶原肽提取率逐渐增加, 至50℃达到最高, 说明该酶的最适温度约为50℃, 温度偏低影响酶活力的发挥, 而温度偏高则会造成酶一定程度的变性失活。因此, 选择45, 50, 55℃作为正交水平。

图3 酶解温度对鱼皮胶原肽提取率的影响

（4）pH值对提取率的影响

pH值对鱼皮胶原肽提取率的影响见图4。

图4 pH值对鱼皮胶原肽提取率的影响

由图4可知, 当酶解体系pH值为7.0时提取率最高, 说明该酶的最适pH值约为7.0, pH值偏低或偏高都会造成酶变性, 降低酶活力。因此, 选择pH值6.0, 7.0, 8.0作为正交水平。

2.2 正交试验优化酶解条件

根据单因素试验结果, 利用L9（34）正交试验确定影响胶原肽提取率的主要因素和水平。

胶原肽提取正交试验结果见表2。

表2 胶原肽提取正交试验结果

根据极差分析, 4个因素对胶原肽提取率的影响大小为加酶量＞pH值＞酶解时间＞酶解温度。根据k值分析, 最优组合为A2B2C3D1, 即加酶量2.0 mL（0.2 mL/g鱼皮）, 酶解时间5 h, 酶解温度55℃, pH值6.0。在最优条件下进行3次平行试验, 胶原肽提取率为28.51%（湿质量）。

2.3 胶原肽的理化指标和污染物限量评价

根据GB 31645—2018《胶原蛋白肽》的规定, 对本法制备的胶原肽的理化指标和污染物限量进行评价。

胶原肽粉与国家标准部分理化指标的比较见表3, 胶原肽粉与国家标准污染物限量的比较见表4。

表3 胶原肽粉与国家标准部分理化指标的比较

表4 胶原肽粉与国家标准污染物限量的比较/mg·kg-1

通过比较, 采用SCAU胶原蛋白复合酶酶解制备的胶原肽的理化指标和污染物限量均符合GB 31645—2018的标准。总氮含量高, 说明该法制备的胶原肽中蛋白质为主要成分, 纯度高、含水量低, 利于胶原肽的长期保存。

2.4 胶原肽的相对分子量分布

胶原肽飞行时间质谱图见图5。

由图5可知, 经酶解和膜分离后得到的胶原肽分子量主要分布于1195.1～2775.9 Da, 主要集中于1879.0, 1609.7, 1387.5 Da。说明该酶的酶解能力较强, 且酶解后通过微滤和超滤可有效分离分子量较小的胶原肽, 符合GB 31645—2018中对胶原肽分子量的要求。膜过滤方法对胶原肽的结构和活性无影响, 利于提高产品品质。

图5 胶原肽飞行时间质谱图

2.5 胶原肽羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸标准曲线见图6。

图6 羟脯氨酸标准曲线

测得样品吸光度为0.338±0.005, 经计算, 胶原肽羟脯氨酸含量为8.46%。

3 结论

以鱼皮为原料, 通过SCAU胶原蛋白酶酶解、微滤、超滤和冷冻干燥后, 制备胶原肽。最优酶解条件为加酶量0.2 mL/g鱼皮, 酶解时间5 h, 酶解温度55℃, pH值6.0, 胶原肽提取率为28.51%（湿质量）。理化分析表明, 该胶原肽总氮含量为15.4%, 灰分含量为0.1%, 水分为1.1%, 铅和镉含量均小于0.02 mg/kg, 总砷和铬含量均小于0.1 mg/kg, 总汞含量小于0.02 mg/kg。胶原肽的相对分子量主要集中于1879.0, 1609.7, 1387.5 Da, 羟脯氨酸含量为8.46%。理化指标和污染物限量均符合国家标准。