响应面优化超声提取蒲公英多糖及其抗氧化性的研究

刘啸宇, 王秀风, 后梦情, 江思雨, 姚 坤, 2, 吴 萧, 2

（宿州学院生物与食品工程学院, 安徽宿州 234200）

蒲公英（Herba Taraxaci）是桔梗目菊科植物, 在一系列的药食同源类植物中属于多年生宿根型。在2000年时我国的蒲公英栽培种类就有70种[1], 分布相对较多的地区为我国的西南、西北区[2]。其中, 有27种蒲公英可以药用, 药用蒲公英组（Taraxacum officinale）主要应用于药用方面, 如蒙古蒲公英、热河蒲公英等[3]。蒲公英中含有多种对人体有益的天然化学成分, 如蒲公英醇、胡萝卜素类、植物甾醇类、黄酮类、果胶等。

多糖作为植物蒲公英的重要构成组分, 在不同部位的多糖含量也是不一样的, 有关研究表明, 同一株蒲公英不同部位的多糖含量为根＞花＞叶[4], 但根中所含的多糖大多属于贮存性多糖, 而叶与花中的多糖功能性较强。多糖的提取方法也有很多种, 如热水浸提法[5]、超声波提取法[6]、微波提取法[7]等。其中, 超声波提取分离的方法在中药类植物成分的提取中应用较为广泛。试验旨在研究功能性多糖的抗氧化性, 以蒲公英叶为材料, 采用超声波提取法, 通过单因素试验, 再利用响应面分析软件确定蒲公英多糖超声波提取的最佳试验工艺。由于蒲公英多糖具有抗突变、抗疲劳和提高免疫[8-9]等的重要作用, 而试验又旨在探索其抗氧化作用。因此, 利用在最佳工艺水平下提取的蒲公英多糖, 研究其对DPPH自由基和羟基自由基（·OH）的清除效果, 探索其抗氧化活性, 以便为更好地开发利用蒲公英多糖资源提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 仪器设备

HH-30B型多功能粉碎机, 巩义市宏华仪器设备工贸有限公司产品；722型可见分光光度计, 上海元析仪器有限公司产品；KQ5200DE型数控超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司产品；JA5003N型电子天平, 上海菁海仪器有限公司产品；HH-2型数显恒温水浴锅, 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司产品。

1.1.2 主要试剂

干蒲公英叶, 购自宿州市中药房；葡萄糖标准品、5 %苯酚、DPPH（分析纯）, 国药集团化学试剂有限公司提供；无水乙醇（分析纯）, 安徽安特食品股份有限公司提供；水杨酸（分析纯）, 天津市大茂化学试剂厂提供；硫酸亚铁（分析纯）, 上海展云化工有限公司提供；30%过氧化氢（分析纯）, 西腾化工股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

准确称取50.00 mg葡萄糖标准品放入烧杯中, 加适量蒸馏水溶解, 转移到50 mL的容量瓶并定容至刻度线, 配制成质量浓度1 mg/mL的葡萄糖溶液待用。从已配制的葡萄糖溶液中分别吸取0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mL依次放入试管中, 并用蒸馏水补足使各试管中溶液达到2.0 mL, 采用硫酸-苯酚法测定波长490 nm处的吸光度。记录数据绘制标准曲线并得到标准回归方程, 其中横坐标是葡萄糖溶液质量浓度, 纵坐标是吸光度。

1.2.2 样品液的制备

粉碎干蒲公英叶, 用80目筛过筛备用。称取1.0 g的蒲公英粉置于锥形瓶中, 加入适量蒸馏水, 超声提取, 提取液置于离心机中进行离心取上清液, 即得到多糖样品液。

1.2.3 蒲公英多糖得率的计算

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[10], 公式如下：

式中：C——蒲公英多糖的质量浓度, mg/mL；

F——多糖提取液的稀释倍；

V——多糖溶液体积, mL；

m——称取的蒲公英粉质量, g。

1.2.4 蒲公英多糖提取的单因素试验设计

分别考查超声温度（50, 55, 60, 65, 70℃）、提取时间（20, 30, 40, 50, 60 min）、超声功率（70, 90, 110, 130, 150 W）、料液比（1∶30, 1∶35, 1∶40, 1∶45, 1∶50）对蒲公英多糖提取率的影响, 将每次得到的提取液进行离心取上清液获得蒲公英多糖的样品液, 取适量的样品液按上述1.2.3操作, 根据1.2.3中的公式计算多糖含量。

1.2.5 响应面优化试验设计

利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-benhnken设计法, 设计四因素三水平的响应面优化分析, 并将4个因素的试验编码为-1, 0, 1这3个水平, 试验的响应值选择蒲公英多糖的提取率（Y）。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.2.6 蒲公英多糖抗氧化性的研究

（1）对DPPH自由基清除力的测定。参照李敏等人[11]的方法, 采用DPPH法进行测定。根据1.2.5的响应面优化结果, 并在此条件下提取蒲公英多糖, 将提取液的质量浓度配制为1 mg/mL。首先把多糖提取液按比例稀释成质量浓度为1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5 mg/mL的一系列样品液。接着配置DPPH溶液, 准确称量DPPH 7.00 mg, 用无水乙醇溶解, 在100 mL容量瓶中定容, 放置备用。分别吸取DPPH溶液2.0 mL于各试管中, 再加入1.5 mL不同质量浓度的多糖提取液, 最后加0.5 mL蒸馏水, 摇匀, 置于暗处反应30 min, 于波长517 nm处测定吸光度。蒲公英多糖对DPPH自由基的清除率计算公式：

式中：A0——用蒸馏水代替多糖溶液的吸光度；

A1——用蒸馏水代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；

A2——不同梯度多糖溶液的吸光度。

（2）对羟基自由基清除力的测定。参考付学鹏等人[12]的方法, 采用水杨酸比色法。根据1.2.5的响应面优化结果, 并在此条件下提取蒲公英多糖, 将提取液的质量浓度配制为1 mg/mL。再用蒸馏水将配制好的多糖提取液按比例稀释为不同质量浓度0.03, 0.06, 0.09, 0.12, 0.15 mg/mL的样品溶液。在各试管中依次加入浓度8 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、8 mmol/L水杨酸溶液2.0 mL、不同质量浓度的多糖提取液2.0 mL, 最后加入2.0 mL 8 mmol/L的H2O2溶液, 待各试管中溶液反应10 min后, 于510 nm处测定吸光度。蒲公英多糖对羟基自由基清除率计算公式：

式中：A0——用蒸馏水代替多糖溶液所测吸光度；

A1——不同质量浓度多糖提取液所测吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

将配置的不同质量浓度的葡萄糖标准品溶液, 使用可见分光光度计于波长490 nm处测定吸光度, 以葡萄糖标准液质量浓度作为横坐标, 吸光度作为纵坐标绘制成标准曲线。标准曲线回归方程为：

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 蒲公英多糖提取的单因素试验结果

2.2.1 超声温度对蒲公英多糖得率的影响

超声温度对蒲公英多糖得率的影响见图2。

图2 超声温度对蒲公英多糖得率的影响

由图2可知, 刚开始蒲公英多糖得率随超声温度升高而逐渐增大, 当温度达到60℃时, 多糖得率同样达到最高值。而当温度大于60℃时, 多糖得率又逐渐下降。这是因为当温度过高时, 空化作用减弱且过高的温度也会影响多糖活性。因此, 多糖提取温度应选定60℃左右。

2.2.2 超声时间对蒲公英多糖得率的影响

超声时间对蒲公英多糖得率的影响见图3。

图3 超声时间对蒲公英多糖得率的影响

由图3可知, 超声时间为20～40 min时, 蒲公英多糖得率逐渐升高, 在40 min时得率达到顶峰, 后期的蒲公英多糖得率随时间延长而下降。这可能是由于长时间的提取会破坏多糖的结构, 造成多糖的损失, 从而影响多糖得率。因此, 蒲公英多糖提取超声时间应该控制在40 min左右。

2.2.3 超声功率对蒲公英多糖得率的影响

超声功率对蒲公英多糖得率的影响见图4。

图4 超声功率对蒲公英多糖得率的影响

由图4可知, 当功率达到110 W时, 多糖得率最大。伴随着超声功率的不断升高, 多糖得率开始不断下降, 且趋势非常明显。这是因为在过高的功率作用下多糖分子结构遭到破坏, 造成溶液中多糖量的损失。因此, 超声萃取蒲公英多糖时的超声功率控制在110 W左右。

2.2.4 料液比对蒲公英多糖得率的影响

料液比对蒲公英多糖得率的影响见图5。

图5 料液比对蒲公英多糖得率的影响

由图5可知, 随着料液比的增加蒲公英多糖得率先上升后下降, 以1∶45的料液比为转折点, 多糖得率开始下降。当料液比较小时, 蒲公英粉不能在溶剂中充分溶解, 导致多糖得率值不大, 随着料液比中溶剂量的增多, 样品与其接触就更充分, 多糖的溶出量增大, 从而使多糖得率增加。但过大的料液比会相应的增加成本和时耗。因此, 料液比选择在1∶45左右。

2.3 响应面法优化提取工艺

2.3.1 响应模型建立与分析

根据四因素三水平设计的29组试验, 得出试验数据结果。

Box-behnken试验设计和响应值见表2。

对表2数据进行拟合, 得到二次多项式回归模型方程为：

表2 Box-behnken试验设计和响应值

回归模型方差表（ANOVA）见表3。

由表3可知, 决定系数（R2）为0.8009和调整后的决定系数（R2Adj）为0.6018, 这2个系数反映了实际测量值与预测值之间的相关性。而模型中的失拟项Prob＞F的值为0.4455, 大于0.05, 则表明此模型的拟合度良好, 完全可以采取模型方程取代试验真实点来对分析和预测试验值, 且一次项系数X1对于蒲公英多糖超声提取的影响是极显著, 而系数X2、X4仅为影响显著。比较F值可以得出, 各单因素对蒲公英多糖得率的影响力强弱为超声温度＞超声时间＞料液比＞超声功率。

表3 回归模型方差表（ANOVA）

2.3.2 响应面交互作用的分析

（1）超声温度与其他因素间的交互作用。

超声温度和超声时间的等高线和3D曲面图见图6, 超声温度和超声功率的等高线和3D曲面图见图7, 超声温度和液料比的等高线和3D曲面图见图8。

图6 超声温度和超声时间的等高线和3D曲面图

由图6～图8可知, 超声温度分别与超声时间、超声功率、料液比间两两作用对多糖得率的影响。在图6中, 由于其3D曲面图整体坡度较陡, 即代表超声温度与超声时间相互作用对试验结果影响较大。蒲公英多糖得率的最佳条件为超声温度55～65℃, 超声时间35～45 min。而图7、图8中曲面图较为平坦, 表明这两对因素交互作用对多糖得率的影响没有图6显著。

图7 超声温度和超声功率的等高线和3D曲面图

图8 超声温度和料液比的等高线和3D曲面图

（2）超声时间与超声功率、料液比间的交互作用。

超声时间和超声功率的等高线和3D曲面图见图9, 超声时间和液料比的等高线和3D曲面图见图10。

由图9、图10可知, 2组图的3D曲面图都是弯曲度较大的, 说明超声时间与超声功率、料液比对多糖得率有一定程度影响。图中多糖得率较大的点从时间上看在35～45 min, 其中一个超声功率在106～122 W, 另一个的料液比在1∶39～1∶45。

图9 超声时间和超声功率的等高线和3D曲面图

图10 超声时间和料液比的等高线和3D曲面图

（3）超声功率与料液比间的交互作用。

超声功率和料液比的等高线和3D曲面图见图11。

由图11可知, 适宜提取蒲公英多糖的条件在超声功率108～122 W、料液比为1∶39～1∶45。但由于这组图中的3D曲面图更接近于平面图, 所以在多糖提取时超声功率与料液比间的交互作用对其提取率影响不大。

图11 超声功率和料液比的等高线和3D曲面图

2.3.3 最优工艺的调整和验证

根据Design Expert 8.0.6软件中的模型得到4个变量的最优值, 分别是超声温度63.97℃, 超声时间41.13 min, 超声功率115.16 W, 料液比1∶43.21（g∶mL）, 该模型预测在最优条件下蒲公英多糖得率为2.47 %。为验证响应面优化得出的试验方法是否可行, 对最优条件进行调整, 在调整后的最优条件下提取。

试验结果验证见表4。

表4 试验结果验证

同样, 把超声波清洗器调到最优水平, 3次重复试验进行提取, 测定求出多糖得率, 结果表明在最优条件下多糖得率为2.32%, 与预测数据较为接近, 可以验证模型的可行性。

2.4 蒲公英多糖抗氧化性研究结果

2.4.1 对DPPH自由基清除能力的测定

以多糖的不同质量浓度梯度为横坐标, 于波长517 nm处测定吸光度并计算清除率。

不同多糖质量浓度对DPPH自由基的清除能力见图12。

图12 不同多糖质量浓度对DPPH自由基的清除能力

由图12可知, 蒲公英多糖对DPPH自由基具有明显的清除效果, 并且其清除能力随多糖质量浓度增大而上升, 当多糖质量浓度达到1.4 mg/mL时, 清除率已达到82.43%清晰的表明多糖有较好的抗氧化性。

2.4.2 对羟基自由基清除能力的测定

以多糖的不同质量浓度梯度为横坐标, 于波长510 nm处测定吸光度并计算清除率。

不同多糖质量浓度对羟基自由基的清除能力见图13。

图13 不同多糖质量浓度对羟基自由基的清除能力

由图13可知, 蒲公英多糖的质量浓度与其对羟自由基的清除力呈正相关, 随多糖质量浓度的上升, 清除效果明显增强。当质量浓度为4.5 mg/mL时, 清除率为43.79%；在4.5～5.0 mg/mL时, 多糖对羟自由基的清除率上升不明显, 基本趋于稳定。

3 结论

试验利用Box-behnken Design（BBD）优化超声波提取蒲公英多糖的工艺条件, 结果表明多糖得率在超声温度63.97℃, 超声时间41.13 min, 超声功率115.16 W, 料液比1∶43.21（g∶mL）的条件下提取最佳, 多糖提取率达到2.47%。而在实际操作中, 对响应面软件给出的最优条件进行适当调整, 在超声温度64℃, 超声时间41 min, 超声功率115 W, 料液比1∶43（g∶mL）下, 多糖得率为2.32%与预测值接近。

通过多糖对DPPH自由基、羟基自由基的清除率反映其显著的抗氧化能力, 在多糖质量浓度达到1.4 mg/mL时, 对DPPH自由基的清除率达到82.43%；当质量浓度为4.5 mg/mL时, 清除率为43.79%。从数据中可以明显看出, 蒲公英多糖所具有的抗氧化性, 对于开发利用蒲公英叶资源提供参考。但试验在多糖提取时缺少蒲公英多糖的分离纯化步骤, 仅进行了多糖的粗提取, 并且没有根据蒲公英的成长阶段、生产地点等方面分类进行精细研究, 还需进一步研究。