基于网络药理学方法分析葛根汤和黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的作用机制*

赵晓，黄飞麒，陈扬声，魏源标，林展，张晓辉

（1.广东药科大学附属第一医院，广东广州 510080；2.广州体育学院，广东广州 510620）

颈椎病是指颈椎间盘组织发生退行性改变，以及其继发病理改变累及到包括神经根、脊髓、椎动脉、交感神经、脊髓前中央动脉等的周围组织结构，并出现与影像学改变相符合的临床表现[4]。临床上可分为颈型、神经根型、椎动脉型、交感型、脊髓型、混合型和食道型，其临床表现有颈肩背痛、头晕头痛、上肢放射痛或麻木、肌肉萎缩、严重者双下肢痉挛、行走困难，甚至四肢麻痹，大小便障碍，瘫痪等[5]，是骨科常见疾病之一。近年来随着电子产品尤其是智能手机的普及，颈椎病的发病率呈上升趋势。长时间低头工作或保持单一固定姿势或不良卧姿是该病重要的诱发因素[1]。流行病学调查发现高达73.2%的人患有颈肩痛，伏案工作人群颈肩痛的发生率为78.3%，且随着每天伏案工作时间的延长，该病的发生率逐渐升高[2,3]。因此，颈椎病的预防及早期治疗显得尤为重要。目前，对于颈椎病的治疗有手术治疗和保守治疗，其中，保守治疗方法方式多样，疗效确切，临床常用保守治疗方法有中西医药物治疗、针灸、推拿正骨、物理治疗、小针刀治疗、康复锻炼等[6]。在这些疗法中，颈椎病暂无特效药物，西医药物治疗多采取对症治疗为主，整体和远期疗效欠佳，且临床广泛应用的非甾体类消炎药有着较高的胃肠道和心血管方面的副作用风险[7]；针灸、推拿正骨、物理治疗、小针刀、康复锻炼等方法虽然疗效相对确切，但存在疗程长[8]或者创伤性大[9]，导致患者依从性较低。

中药内服治疗颈椎病，经历了早期的临床个案报道、临床疗效总结、临床实验研究、动物实验研究等阶段，已取得较大进展,但所用药物达数目繁多，可达150多种，重复性差[10]。研究组在临床工作中曾单独使用葛根汤合黄芪桂枝五物汤来治疗颈椎病，发现效果显著，这两个方剂都是出自于《伤寒杂病论》，临床研究[11-14]证实上述两个方剂的疗效确切，显效率高于西医药物治疗。在文献回顾中，研究组发现对这两个方剂的研究大多处于临床研究阶段，极少对其进行药理研究及治疗的作用靶点的研究。本研究利用网络药理学方法探讨葛根汤及黄芪桂枝五物汤通过何种成分，利用机体的哪些靶点的作用，最终达到治疗颈椎病的目的。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分的筛选和靶点 将葛根汤处方各药味的中文名称“葛根”，“麻黄”，“桂枝”，“生姜”，“甘草”，“大枣”，“白芍”以及黄芪桂枝五物汤中各中药的中文名称“黄芪”，“桂枝”，“大枣”，“生姜”，“白芍”分别作为两组关键词，输入中药系统药理学数据库和分析平台[15](Traditional ChineseMedicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)，最后在CNKI上检索相关文献，并整理出未纳入的中药成分进行整理补充。获取所有中药成分以后，录入TCMSP平台以匹配信息，筛选活性成分条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[16]。

1.2 构建葛根汤及黄芪桂枝五物汤的“活性成分-靶点”网络 葛根汤与黄芪桂枝五物汤的“活性成分-靶点”网络主要通过软件Cytoscape 3.8.0来构建与分析，其中成分或靶点用“节点”(node)表示，二者之间的关系用“边”(edge)表示。

1.3 cervical spondylosis相关靶点检索以“cervical spondylosis”作为关键词，在Genecards[17]数据库、Disgenet[18]数据库、OMIM数据库的疾病基因数据库进行检索与筛选，将得到的靶点汇总并去除重复值，再根据文献报道查找未预测到的有效成分的已知靶点，并利用Uniprot数据库将所得靶点标准化。

1.4 建构靶蛋白相互作用（PPI）网络 先取葛根汤与黄芪桂枝五物汤的交集靶点，再将汤剂的交集靶点与cervical spondylosis相关靶点取交集，最后将这部分靶点输入string网站，基于STRING数据库（http://string-db.org/）对筛选出的基因靶点构建相互作用关系网络，把参数中的第一层最大交互者数设置为：不超过10个交互器，第二层设置为：不超过20个交互器，把最低互动得分设置为：中置信度（0.4000）。使用BisoGenet数据库对筛选出的基因靶点构建相互作用关系网络，可得到治疗cervical spondylosis的PPI网络图，将所得图导入Cytoscape 3.8.0软件，绘制出PPI网络图。

1.5 关键靶点富集分析 将最终取得的核心靶点导入David[19,20]数据库，进行基因本体（Gene Ontology，GO）分类富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encycloped of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。其中GO富集分为细胞组分(cell component，CC)、生物过程(biological Processes，BP)和 分 子 功 能(molecular function，MF)三种。由于富集靶标的数目和P有相关性，富集靶标越多，则表示与治疗cervical spondylosis相关性越密切，其P值就会越小，本研究团队选取GO富集数据中P＜0.01的结果数据，由大到小进行排序，将上述数据输入微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制富集GO term BP，CC，MF三合一柱状图。选取COUNT数目排名前9的KEGG通路，使用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制气泡图，并将COUNT数目排名前5名的通路数据的基因名及通路名称使用Cytoscape3.8.0软件绘制通路关系图。

2 结果

2.1 葛根汤和黄芪桂枝五物汤成分的筛选和靶点

2.1.1 葛根汤成分的筛选和靶点 以检索TCMSP数据库并根据OB和DL值初步筛选得到葛根汤活性成分371个：其中葛根16个，麻黄18个，桂枝9个，生姜8个，甘草204个，大枣82个，白芍34个；另外共有成分有15个：大枣，甘草，麻黄共有1个成分；大枣，甘草，白芍共有2个成分；大枣，生姜，白芍，葛根，桂枝共有1个成分；大枣，甘草，麻黄共有1个成分；大枣，桂枝，白芍共有1个成分；大枣，甘草共有1个成分；大枣，葛根共有1个成分；甘草，麻黄共有1个成分；白芍，桂枝甘草共有1个成分；甘草，葛根共有2个成分；甘草，白芍，麻黄共有1个成分；甘草，白芍共有1个成分；桂枝，葛根共有1个成分；桂枝，麻黄共有1个成分。将上述活性成分输入uniport网站进行规范，最终得到葛根汤有效基因靶点：其中葛根312个，麻黄356个，桂枝194个，生姜81个，甘草2380个，大枣780个，白芍209个；去除重复值，得出有效基因靶点共194个。方中OB值排名2位的有效成分见下表：

表1 葛根汤方中OB值排名2位的有效成分

2.1.2 黄芪桂枝五物汤成分的筛选和靶点 以检索TCMSP数据库并根据OB和DL值初步筛选得到黄芪桂枝五物汤活性成分180个：其中黄芪47个，桂枝9个，大枣82个，生姜8个，白芍34个；另外共有成分有9个：黄芪，大枣共有3个成分；黄芪，白芍，大枣共有1个成分；白芍，黄芪共有1个成分；桂枝，生姜，大枣，白芍共有1个成分；桂枝白芍共有1个成分；桂枝，白芍，大枣共有1个成分；白芍，大枣共有1个成分。将上述活性成分输入uniport网站进行规范，最终得到黄芪桂枝五物汤有效基因靶点：其中黄芪47个，桂枝194个，大枣780个，生姜81个，白芍209个；去除重复值，得出有效基因靶点共174个。方中OB值排名2位的有效成分见下表：

表2 黄芪桂枝五物汤方中OB值排名2位的有效成分

2.2 葛根汤及黄芪桂枝五物汤活性成分-有效靶点网络构建

2.2.1 葛根汤活性成分-有效靶点网络构建 将检索出的葛根汤有效靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中，构建葛根汤有效靶点网络图（图1）。图中下面黄色部分表示药物的靶点，上面部分表示药物成分：同心圆的外圈蓝色四边形表示甘草，同心圆的内圈红色四边形表示大枣，同心圆中间左上紫色四边形表示葛根，同心圆中间右上浅粉红色四边形表示麻黄，同心圆中间左下黄色四边形表示白芍，同心圆中间右下浅绿色四边形表示生姜，同心圆中间右下翠绿色四边形表示桂枝，同心圆中间呈一字排开的深粉红色表示共同的药物成分。由此可见，葛根汤中不同药物可能对应同一成分，同一成分可能对应不同靶点；反之，同一靶点又可能对应不同药物成分，不同药物成分又可能对应同一药物，最终得出葛根汤治疗疾病可以通过不同成分作用于不同靶点而取得疗效。

图1 葛根汤有效靶点网络图

2.2.2 黄芪桂枝五物汤活性成分-有效靶点网络构建 将检索出的黄芪桂枝五物汤有效靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中，构建黄芪桂枝五物汤有效靶点网络图（图2）。图中同心圆的最外圈紫红色圆形节点表示药物靶点，同心圆第二圈土黄色四边形节点表示大枣成分，同心圆第三圈黄色四边形节点表示黄芪成分，同心圆第四圈翠绿色四边形节点表示白芍成分，同心圆第五圈蓝色四边形节点表示桂枝，同心圆第五圈玫红色四边形节点表示生姜，同心圆中心呈矩形排列的粉色八边形节点表示共有成分。由此可见，黄芪桂枝五物汤中不同药物可能对应同一成分，同一成分可能对应不同靶点；反之，同一靶点又可能对应不同药物成分，不同药物成分又可能对应同一药物，最终得出黄芪桂枝五物汤治疗疾病可以通过不同成分作用于不同靶点而取得疗效。

图2 黄芪桂枝五物汤有效靶点网络图

2.3 cervical spondylosis相关靶点检索在Genecards数据库、Disgenet数据库、OMIM数据库的疾病基因数据库以“cervical spondylosis”作为关键词进行检索与筛选，同时根据近5年相关文献查找未纳入到的有效靶点。在Genecards数据库中查找出54个靶点；在Disgenet数据库中查找5个靶点；在OMIM数据库中查找158个靶点，在近5年相关文献未查找未纳入的有效靶点。最终将所取得上述所有靶点汇总去除重复值，并利用Uniprot数据库将所得靶点标准化，最终得到疾病靶点共211个。

2.4 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的靶点、PPI网络构建

2.4.1 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗cervical spondylosis的交集靶点 将葛根汤有效基因靶点与黄芪桂枝五物汤有效基因靶点比对，经过筛选去除重复值，最终得到AR、ESR1、PGR、ACACA、ACHE、ACPP、ADRB2、AHR、ALOX5、BCL2等共170个交集靶点。将所取得的170个交集靶点与2.3中所取得的211个疾病靶点再次取交集，最终取得ESR1、IFNG、IL1B、IL6、MMP3、PTGS2、SOD1、TNF、TP53、COL3A1、DRD5、HMGCR共12个交集靶点。

2.4.2 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的PPI网络构建将最终筛选出来的共同靶点导入STRING数据库获取靶蛋白的相互作用关系。虽然葛根汤及黄芪桂枝五物汤交集靶点与cervical spondylosis共有的靶点只有12个，但葛根汤及黄芪桂枝五物汤对cervical spondylosis的治疗作用，并不仅限于靶点直接相互作用。因为每个靶点都处在蛋白相互作用关系网络中，所以药物和疾病靶点之间即便没有直接相互作用，药物和疾病靶点蛋白互作网络之间也可能产生联系。因此研究药物对疾病的作用机制，不仅要研究直接作用靶点，还要研究蛋白互作网络中间接作用机制。因此笔者把STRING网站上的参数中的第一层最大交互者数设置为：不超过10个交互器，第二层设置为：不超过20个交互器，把最低互动得分设置为：中置信度（0.4000）。将扩增所得到靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中的bisogenet插件获取靶蛋白的相互作用关系。使用Biso-Genet数据库对筛选出的基因靶点构建相互作用关系网络，可得到葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗cervical spondylosis的PPI网络图，将所得图导入Cytoscape 3.8.0软件，绘制出PPI网络图（图3）。该PPI网络图共包含三个小图，左侧图为通过原始交集靶点作出的网络图，包括3661个节点，125936条边，经过计算得出BC、CC、DC的中位数分别为0.00000848、0.439、47，以此为条件截取出中间图；中间图包括1470个节点，62543条边，经过计算得出BC、CC、DC的中位数分别为0.00291、0.465、96，以此为条件截取出右侧图；中间图包括450个节点，16152条边，图中节点越大，图中节点越大代表degree值越大，degree值排名在前5位的靶蛋白：TP53（抑癌基因53），NTRK1（1型神经营养性酪氨酸激酶受体），ESR1（雌激素受体1），CUL3，APP（淀粉样前体蛋白）。

图3 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的PPI网络图

2.5 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗cervical spondylosis的富集分析

将PPI网络中的450个核心靶点基因导入DA-ⅤID数据库，进行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

2.5.1 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的GO富集分析GO富集分析结果显示，450个相关靶点基因其中有430个核心靶点基因参与富集，共得到379个富集结果，其中包括分子功能（MF）98项，主要涉及蛋白结合、泛素蛋白连接酶结合、酶结合等；细胞组成（CC）178项，主要涉及细胞核、细胞胞浆、细胞核浆等；生物过程（BP）103项，主要涉及病毒过程、抑制表观遗传、促进及抑制RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录等。选择P值＜0.01的富集结果，输入微生信网络，作图如下（图4）：

图4 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的GO富集分析

2.5.2 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗cervical spondylosis的KEGG通路富集分析KEGG分析结果：450个相关靶点基因，其中有354个核心靶点基因参与115条信号通路过程，筛选COUNT数目排名前9位的通路，输入微生信网络（图5），将基因数目排名前20位相关基因及通路导入Cytoscape 3.8.0绘制相关基因及通路关系图（图6）。

图5 葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗cervical spondylosis排名前9位的KEGG通路

图6 相关基因及通路关系图

通过KEGG富集通路分析发现，肿瘤通路，HTLⅤ-I感染，乙肝，MAPK通路，细胞周期，病毒致癌过程，EB病毒致癌过程等通路与葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗cervical spondylosis的靶点关系密切。相关基因数最高的两条通路如下：

图7 癌症相关基因及通路关系图

图8 致癌作用病毒相关基因及通路关系图

3 讨论

颈椎病是指颈椎间盘组织发生退行性改变，以及其继发病理改变累及到包括神经根、脊髓、椎动脉、交感神经、脊髓前中央动脉等的周围组织结构，因此目前临床治疗多从松解颈背部肌肉、调整颈椎的生理曲度及关节突关节等方面入手，短期效果明显，但容易反复发作，长期效果欠佳。文献回顾中发现研究切入点以炎症因子[21]、细胞增殖与细胞周期[22,23]等方向为主，均能取得较好的疗效。

葛根汤出自《伤寒论》，原方组成为：葛根四两、麻黄三两(去节)、桂枝二两(去皮)、芍药二两(切)、甘草二两(炙)、生姜三两(切)、大枣十二枚(擘)，具有发汗解表，升津舒筋之功效。黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略》，原方组成为：黄芪三两、桂枝三两、芍药三两、生姜六两、大枣十二枚，具有补益气血、通阳行痹、调和营卫的功效。两方药味精简，配伍得当，问世近两千年来疗效显著。两方虽主治功效迥异，但在现代骨科临床上常合方用于治疗颈椎病，能收获较好疗效。

本研究基于网络药理学，探讨葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的作用机制，共收集到葛根汤活性成分371个；黄芪桂枝五物汤活性成分180个；治疗疾病的作用靶点共211个，提示葛根汤及黄芪桂枝五物汤可以利用不同有效成分通过多个靶点蛋白治疗颈椎病。PPI网络图提示葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的作用机制较为复杂，核心靶点涉及的范围可以分为细胞增殖及其周期、泛素化、炎症因子及伤口愈合相关指标，GO和KEGG富集分析结果显示，葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病涉及不同的生物过程及不同的信号通路，如肿瘤通路，MAPK通路，细胞周期，病毒致癌过程，EB病毒致癌过程等。本次网络药理研究结果PPI发现葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病degree值排名前30的核心蛋白主要参与调节软骨及椎间盘细胞增殖凋亡以及调节细胞周期、促进神经修复等过程。如①TP53为细胞周期研究领域中的明星分子，目前体外细胞证实抑制TP53可促进人髓核细胞增殖作用[24]；同时亦有动物实验证实干扰ESR1的表达可以通过抑制软骨细胞凋亡进而促进细胞的增殖[25,26]；对于大鼠神经细胞的研究证实APP可抑制神经细胞凋亡,从而改善神经功能恢复[27]。②NTRK1与神经元修复有密切关系，动物实验证实过表达NTRK1能够促进神经元的再生[28]。分析P值排名前20位的KEGG通路可以发现葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的主要通路可以分为以下几类：①调节神经及软骨细胞的增殖、侵袭及凋亡：已经有临床研究观察到MAPK信号通路的激活会促进人颈椎椎间盘的退化[29]，动物实验研究及文献综述表明调控MAPK信号通路的激活，可以影响神经及软骨细胞的增殖速度，从而调节两者的细胞周期[30,31]。基于上述结论，研究组推测对于治疗颈椎病同样可以通过抑制上述通路的功能，达到控制调控神经及软骨细胞的有丝分裂，促进细胞增殖，延长细胞周期，从而治疗颈椎病。②与肿瘤相关性：在本次网络药理研究中发现KEGG富集的结果有很多与恶性肿瘤的发生发展有关的信号通路。颈椎病在治疗期间，需要让局部组织有持续的血管新生，局部炎症反应的减缓等过程。而这一系列的过程均与肿瘤的持续血管新生，促肿瘤炎症反应等恶性肿瘤获得性特征[32,33]相类似。研究组在回顾文献中也发现目前有不少对滋养细胞的研究也以恶性肿瘤获得性特征作为切入点[34-36]，因此研究组推测日后研究葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的作用可以借鉴肿瘤相关通路来完成。

综上，葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的主要成分可能是槲皮素、芍药苷、β-谷甾醇、芒柄花黄素、（+）-儿茶素、甘草酚等，主要通过TP53等蛋白通过肿瘤信号通路等信号通路影响多种生物行为。本次网络药理实验同时发现了部分核心靶点分子及富集所得通路尚未被深入研究，同时根据文献回顾结果，目前此类研究的对象集中在骨关节炎、脑缺血、帕金森病等模型，多以手法治疗、针灸治疗或针药结合等作为干预手段，而研究药物直接对颈椎椎间盘，软骨形成，血管新生等的作用的试验并不多见。由此，研究组推断本次网络药理学研究为进一步明确葛根汤及黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的机制开辟了新方向，但目前对于复方成分中不同药物的药量及相互作用分析仍缺乏系统研究模型，此后，我们可以进一步建立研究模型以实验的方式来明确之间的区别。