AQP4、FASN、EphA2在脑膜瘤组织中的表达及相关性研究

李丽青，冯 景，刘东旭,刘 颖

(1.河北省保定市第二医院神经外科，河北 保定 071051；2.河北省定州市人民医院神经外科，河北 定州 073000；3.河北省保定脑血管病医院神经外科，河北 保定 071028)

脑膜瘤属于中枢神经系统肿瘤中较为常见的原发性颅内肿瘤疾病，其发生多以良性为主，该疾病在早期无明显的临床症状，后期可因为肿瘤的变化对神经系统造成压迫而出现临床症状，且女性的发病率高于男性[1]。临床对于脑膜瘤的治疗常以手术的方式为主要治疗手段，虽然肿瘤在进行手术中被完全切除，但也会存在5%～15%的复发率，并且复发率会随着病情分级程度的升高而提高，对患者正常生活造成不可估量的严重影响[2]。因此，为了让脑膜瘤得到及早的发现和治疗，寻找较为有效的治疗手段已成为当下相关临床工作者十分重要的研究任务之一。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)属于机体内的内在蛋白家族成员之一，是一种选择性的水通道内在膜蛋白，在脑内分布较为广泛，能够准确反应脑部疾病[3]。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)是催化细胞内的关键酶，作用于脂酸的合成和运转，在多种肿瘤疾病中呈现出异常高水平表达，促进肿瘤细胞的增殖和转移[4]。上皮细胞激酶 A2(epithelial kinase A2，EphA2)广泛存在于机体大脑内，属于一种酪氨酸激酶受体超家族中的成员之一，在机体组织中呈现出低表达水平，当出现肿瘤病变，会出现急剧上升状态，参与肿瘤的营养供应[5]。既往虽有相关研究分别对其在脑膜瘤中的相关机制进行分析，但关于三者之间的相关性以及与该疾病的相关性研究较少。鉴于此，本研究将分析AQP4、FASN、EphA2在脑膜瘤组织中的相对表达量以及对在脑膜瘤中的相关性研究进行分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取2018年1月—2021年6月在我院收进行治疗的脑膜瘤患者43例，切其脑膜瘤组织，将其分为脑膜瘤组，其中包括男性16例，女性27例，年龄26～56岁，平均(42.03±9.11)岁，依据WHO中枢神经系统肿瘤分级标准[6]，对脑膜瘤进行分级，其中Ⅰ级23例，Ⅱ级14例，Ⅲ级6例。同时选取因外伤手术而切除的脑膜组织43例，其中男性15例，女性28例。年龄23～61岁，平均(41.12±7.55)岁。

患者对本研究均知情并签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。

1.2纳入标准和排除标准 纳入标准：①符合欧洲神经肿瘤协会对脑膜瘤的诊断和治疗标准[7]；②患者术前未接受放疗治疗；③均为首次手术标本；④脑膜瘤患者均为首次发病；⑤一般资料齐全。排除标准：①术前具有放化疗史；②伴有其他恶性肿瘤疾病者；③既往具有相关脑血管病史者；④进行过相关颅脑手术者。

1.3方法

1.3.1AQP4相对表达量检测 提取正常脑膜组织、脑膜瘤组织标本各100 mg。采用反转录-聚合酶链反应法测定AQP4相对表达量，采用AQP4试剂盒(上海将来实业股份有限公司)提取血液内RNA，进行cDNA合成和扩增，条件参数为预火90 ℃，预变性30 min，取出降温至90 ℃，变性5 s，迅速降温至58 ℃，退火20 s，温度保持60 ℃，延伸45 s，40个循环，重复实验3次。内参GAPDH上游引物：5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′，下游引物：5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3V；AQP4上游引物：5V-ATTGGGAGTCACCACGG-TTCAT-3′，下游引物：5′-TGGATTCATGCTGGC-TCCGGTATV3′。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct方法计算AQP4相对表达量。

1.3.2FASN、EphA2相对表达量检测 采用免疫组织化学法测定FASN、EphA2表达，将待检脑膜瘤组织、正常脑膜组织石蜡切片(切片厚度5 μm)脱蜡至水，并经10%的多聚甲醛进行固定，二甲苯透明，3% H2O2条件下避光孵育5～8 min，蒸馏水/PBS分别洗涤2/3次，梯度乙醇脱水，并进行石蜡包埋，常温孵育5 min，去除PBS，滴加一抗(兔抗鼠)，4 ℃孵育过夜，次日PBS缓冲液洗涤3次，5 min/次，加入DAB显色6 min，根据颜色变化(棕色本底出现)终止反应，通过苏木精进行复染、中性树胶封固后，通过使用电子显微镜(北京Quantum量子科学仪器贸易有限公司，型号：LVEM5)×400进行观察。记录其相对表达量。

1.4统计学方法 应用SPSS 26.0统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本t检验、配对t检验、F检验，采用GraphPad Prism 7.0软件进行ROC曲线分析AQP4、FASN、EphA2对脑膜瘤的预测价值，采用Pearson相关性分析相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1正常脑膜组织、脑膜瘤组织AQP4、FASN、EphA2相对表达量比较 与正常脑膜组织对比，脑膜瘤组织AQP4、FASN、EphA2相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 正常脑膜组织、脑膜瘤组织AQP4、FASN、EphA2相对表达量比较

2.2不同临床病例特征组AQP4、FASN、EphA2表达对比 AQP4、FASN、EphA2相对表达量与脑膜瘤患者的年龄、肿瘤直径、脑膜尾征无明显相关性，差异无统计学意义(P>0.05)。AQP4、FASN、EphA2相对表达量与脑膜瘤分级、瘤周水肿、骨侵犯具有相关性，有统计学差异(P<0.05)。其中Ⅱ级、Ⅲ级、有瘤周水肿、存在骨侵犯的AQP4、FASN、EphA2相对表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征组AQP4、FASN、EphA2相对表达量对比

2.3脑膜瘤组织中AQP4、FASN、EphA2的相关性 脑膜瘤组织的AQP4、FASN表达呈正相关(r=0.506，P<0.001)；FASN、EphA2表达呈正相关(r=0.528，P<0.001)；AQP4EphA2表达呈正相关(r=0.507，P<0.001)。见图1。

图1 AQP4、FASN、EphA2之间相关性分析

2.4AQP4、FASN、EphA2表达对脑膜瘤的预测价值 ROC曲线分析显示，与AQP4、FASN、EphA2单项诊断相比，三项联合对脑膜瘤的诊断价值较高(P<0.05)。见表3，图2。

表3 ROC曲线图分析AQP4、FASN、EphA2表达对脑膜瘤的预测价值

图2 ROC曲线图

3 讨 论

脑膜瘤在颅内原发性肿瘤中较为常见，而对于脑膜瘤治疗的主要手段，临床常以手术为主[8]。当下，对于脑膜瘤疾病的发病机制尚未完全明确，可能是由于多种因素致使蛛网膜产生了基因变异，抑或者是因为所处的内环境发生变化而引起，从而使得蛛网膜帽状细胞进行大量增殖，无法进行有效抑制，从而发展为脑膜瘤[9]。据相关研究指出，脑膜瘤的发病机制较为复杂，可能与某些内部环境的变化以及遗传变异等因素相关[10]。经研究表明，AQP4、FASN、EphA2异常表达，与脑膜瘤的发生、发展具有密切关系。故测定不同指标对评估脑膜瘤病情的发展具有重要作用。

AQP4属于中枢神经系统中重要的水通道蛋白，位于机体染色体18q 11.2与q 12.1之间的连接处，主要分布于软脑膜、海马齿状回、下丘脑、小脑蒲内，参与脑部疾病的发展以及脑脊液的形成、吸收全过程[11]。据相关研究指出，AQP4可能机体脑中水分的含量产生一定影响，在一些脑肿瘤疾病中，都会出现AQP4表达升高，由此可认为，AQP4可能与脑水肿、脑膜瘤等疾病的发生具有紧密关联，可能参与该疾病病情发展的全过程[12]。在此基础上，本研究发现，AQP4在脑膜瘤中呈现高表达状态，对肿瘤的发展重要影响。与该上述相关研究结果保持一致。分析原因，高渗透压、pH值降低、缺氧等能够上调AQP4表达，AQP4在脑膜瘤中的表达可能受到以上因素的影响[13]。在脑膜瘤发生后，其机体内的新生血管通透性较高，导致其肿瘤细胞始终处于高缺氧状态，从而上调AQP4表达，而长期的缺氧会导致肿瘤内部呈现酸性，这也可能对AQP4表达产生影响。可见下调AQP4表达可能是控制脑膜瘤进一步发展的关键。

FASN是由2条相同的多肽合成而来，是一种催化内源性脂肪酸并起到关键作用的多功能酶[14]。能够对细胞的脂类代谢进行一定程度的影响，参与内源性之类物质的合成，并且受到营养或激素信号的调控[15]。据相关研究表明，在肿瘤疾病当中，FASN呈现高表达，是因为HER2表达升高能够激活PI3K/AKT通过，从而增加FASN的转录、翻译及蛋白稳定，而FASN的过表达也会增强HER2信号传导，促进肿瘤细胞的增殖[16]。由此可认为，FASN与脑膜瘤疾病之间也具有紧密关联，可能参与该疾病的发生、发展。再此基础上，本研究结果显示，FASN的相对表达量在脑膜瘤疾病中呈现异常过表达状态，与上述相关研究结果相符。分析其原因，可能是因为FASN为肿瘤细胞生存的必要条件，且与病情的发展呈正相关，以此得出，FASN可能参与脑膜瘤疾病的发生、发展全过程，并且能够有效反映出脑膜瘤疾病的严重程度，能够在进一步的研究中成为脑膜瘤疾病的关键性诊断指标。

EphA2是130 000 a的跨膜糖蛋白，也是VM相关的重要信号通路蛋白，其中含有976个氨基酸。EphA2能够诱导抑制黏着斑激酶、细胞外调节蛋白激酶，以此来调节机体多种肿瘤细胞的活性，促进其细胞增殖的发生[17]。据相关研究指出，对胃癌患者在进行EphA2表达的研究时发现，与癌旁组织中的EphA2表达量进行对比，癌组织中的EphA2表达量显著升高，并且其表达量与胃癌的分级、浸润程度以及淋巴结转移情况呈现出正相关关系[18]。由此可以看出，EphA2与肿瘤疾病之间具有紧密关联[19]。在此基础上，本研究结果显示，EphA2表达量在脑膜瘤疾病中呈现异常高表达，并且通过实验证实，EphA2表达量在脑膜瘤疾病中的表达情况更为显著，本研究这一结果与上述相关研究结果一致。分析其原因可能是因为，EphA2是VM相关的信号通路蛋白，EphA2在血管生成方面起到重要的调节作用。当疾病发生时，EphA2表达出现异常升高，造成脑部出现缺氧状态，机体血供骤降，从而造成EphA2水平升高。以此，下调EphA2表达，能够有效抑制脑膜瘤疾病的进一步发展，是控制疾病的重要环节。

据相关研究表明，AQP4、FASN、EphA2可能成为检测脑膜瘤的关键性重要指标，能够有效反映患者脑部出现损伤的严重程度，及病情严重程度。在肿瘤患者中常出现AQP4、FASN、EphA2表达上调的情况，是因为当AQP4核定位后，与FASN、EphA2等目标基因进行相互结合，共同参与肿瘤的增殖、侵袭。三者之间能够共同作用，相互抑制，三者表达量的高低变化可能会随着其中某一表达的变化而进行转变。另外依照本研究结果显示，AQP4与FASN之间呈正相关，FASN与EphA之间呈正相关，AQP4与EphA2之间呈正相关，此结果提示着AQP4、FASN、EphA2可能共同参与脑膜瘤疾病的发生、发展。AQP4、FASN、EphA2与此类疾病相关，临床可根据AQP4、FASN、EphA2相对表达量的高低来对病情的严重程度进行评估。另外本文分析三者的相关性，并采用ROC曲线分析三者对脑膜瘤的预测价值，结果显示，三者呈线性相关关系，且三者联合预测脑膜瘤的价值比单一预测价值相对较高，提示着临床可根据三者水平变化评估脑膜瘤疾病，但本文并未深入分析其具体作用机制，因此三者参与此病的机制还需后续研究进一步分析，为临床上脑膜瘤的诊断提供参考。

综上所述，AQP4、FASN、EphA2在脑膜瘤组织中呈现高表达，参与疾病的发生、发展，并且与疾病的严重程度具有紧密相关性，AQP4、FASN、EphA2的表达与脑膜瘤分级、瘤周水肿、骨侵犯之间呈正相关性，且AQP4、FASN、EphA2三者两两之间也就有相关，可能共同作用于脑膜瘤疾病的发展过程。但因本文研究样本量较小，仍需进一步明确AQP4、FASN、EphA2在脑膜瘤中的协同作用机制。