艰难类梭菌表面蛋白研究进展

张慧敏(综述)，李志荣，赵建宏(审校)

(河北医科大学第二医院检验科，河北省临床检验中心，河北 石家庄 050000)

艰难类梭菌(clostridioides difficile,CD)是一种革兰染色阳性，产芽孢的专性厌氧菌，其导致的艰难类梭菌感染(clostridiodes difficile infection,CDI)症状包括腹泻、伪膜性肠炎、中毒性巨结肠等，严重者可导致死亡，近年来发病率和病死率逐渐增高[1]。CD通过芽孢经粪-口途径进入人体或者作为正常寄居菌在肠道内定植，一旦肠道菌群失衡，CD将产生大量肠毒素A(toxin A of clostridoieds difficile A,TcdA)和细胞毒素B(toxin B of clostridoieds difficile,TcdB)，从而导致腹泻等疾病症状[2-3]。因而介导定植的鞭毛、菌毛以及部分表面蛋白也作为毒力因子在CDI中起重要作用[4]。因此，研究CD表面蛋白的功能作用对CDI防治具有重要意义。本文就CD表面蛋白研究进展进行综述。

1 S-层蛋白

许多原核生物会在菌体表面形成一个蛋白层，称为S层(surface layer，S-layers)蛋白，其结构为一个规则的二维次晶阵列[5]。这些蛋白参与艰难类梭菌与宿主肠道细胞黏附，诱导免疫系统对菌体的识别，是重要的药物作用靶点，包含了很多潜在的可用于药物开发的信息。而且，由于S层蛋白位于菌体的最外层，在病原菌与宿主及其免疫系统的相互作用中也发挥着重要作用。艰难类梭菌的S层结构相较于其他细菌S层的特殊之处在于其二维晶体是由异质二聚体构成。slpA基因编码的蛋白前体，在去除信号肽并分泌到细胞外后，由半胱氨酸蛋白酶Cwp84进行第二次裂解，释放出高相对分子质量(high-molecular weight，HMW)和低相对分子质量(low-molecular weight，LMW)SLPs(S-layer proteins)。它们一起形成一个紧密结合的非共价H/L复合物，锚定在细胞表面并组装成S蛋白层[6]。除SlpA外，S层蛋白还包含许多其他功能的表面蛋白，这些表面蛋白均为HMW SLP同源蛋白，统称为细胞壁蛋白家族(cell wall proteins)。CD630菌株的全基因组测序分析显示其共有28个HMW SLP同源基因，这些同源蛋白的共同特征为都具有N-末端信号肽和细胞壁结合结构域，这两个结构之间的结构域的不同使艰难类梭菌S层具有广泛的功能[6]。

1.1SlpA SlpA是艰难类梭菌S层的主要成分，是涉及艰难类梭菌与肠道黏液层相互作用的黏附素之一,HMW-SLP靠近细胞壁，在不同菌株之间高度保守，LMW-SLP靠近外侧，在菌株之间高度可变，是诱导免疫反应的主要蛋白。SLPs可与Hep-2细胞、Vero细胞以及人类胃肠组织等结合。且去除SLPs或者将菌体与抗SLP抗体孵育会降低艰难类梭菌与HeLa细胞的黏附率。LMW-SLP可通过与宿主细胞表面表达的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)相互作用，诱导宿主的促炎免疫反应[7]。SLPs与宿主的天然或适应性免疫防御密切相关，使用来自小鼠骨髓和人树突状细胞的体外研究表明[7]，SLP可诱导树突状细胞成熟，进而激活T辅助细胞。因此，针对SLPs的主动或被动免疫可能成为治疗艰难类梭菌感染的潜在治疗方案。而且，使用抗SLP抗体对仓鼠进行被动免疫能够显著延缓艰难类梭菌感染的疾病进程，延长感染仓鼠的生存时间；在小鼠直肠内接种重组SlpA蛋白可明显降低艰难类梭菌肠道定植率，且接种重组SlpA蛋白的小鼠粪便中特异性IgA的水平也高于对照组[8]。但是，目前基于SLP进行的免疫疗法并不能完全防止艰难类梭菌的感染。

用小角度X射线散射研究显示，H/L复合物表现为LMW-SLP的C端和HMW-SLP的N端连接在一起，形成一个类似于“回形针”排列，其中HMW亚单位的三个CWB2结构组成一个三角棱形[5]。SlpA是由SecA2分泌，之后经过蛋白酶修饰而发挥作用，这一过程需要在细胞壁中停留一定时间。Oatley等[9]认为，细胞壁中存在一个SlpA池，即S层是在肽聚糖的合成部位形成，并且在整个细胞壁上有SlpA的潜在供应源，且这个异二聚体的组装可能需要细胞外的分子伴侣来帮助这一过程并促进定位，同时防止过早的自组装或错误折叠，因此细胞壁中的SlpA池可能成为新的药物靶标。尚没关于分离到slpA突变株的报道，证明SlpA对于艰难类梭菌的生长至关重要，但有研究报道了两株表型为SlpA缺失的突变株，其表现为严重的芽孢形成缺陷，以及对溶菌酶和抗菌肽LL-37的敏感性显著增加。值得注意的是，尽管该突变株毒力显著减弱，其依然能够在小鼠肠道内定植[9]。

总之，对艰难类梭菌SLPs的结构及功能探索将加深对CDI致病机制的理解，为开发针对S层结构及功能的抗菌药物提供了大量的可能性，并有助于开发疫苗和治疗艰难类梭菌相关疾病的新治疗方法。

1.2Cwp84和Cwp13 Cwp84和Cwp13都属于半胱氨酸蛋白酶类，也是S层蛋白的重要组成部分。Cwp84负责切割SlpA形成HMW-SLP和LMW-SLP。将Cwp84编码基因敲除后，细菌表面可以检测到没有被切割的SlpA，培养基中也可检测到SlpA、Cwp2和Cwp66，这些蛋白在野生型中则检测不到。敲除cwp84还会导致菌落形态异常，有聚集的倾向，生长速率也会降低。然而，敲除cwp84基因并不能防止CDI，这可能是由于宿主自身存在具有类似功能的蛋白酶，或是细菌存在其他替代机制。此外，最近的一项研究发现，在导致复发的菌株的生物膜模型中，Cwp84表达增高，这种现象在非复发菌株产生的生物膜中没有观察到，这表明Cwp84与复发感染有关[10]。虽然敲除cwp84基因不能防止CDI，但用Cwp84免疫过的仓鼠感染模型中，艰难类梭菌在肠道的定植率降低，总体生存率也有所提高[11]。在最近一项基因多态性分析中认为，cwp84虽然高度保守，但它的抗原性和免疫原性在表面相关蛋白中最低，表明Cwp84可能不是开发疫苗的合适目标[12]。Cwp13与Cwp84具有高度相似性，但与Cwp84不同的是，Cwp13的切割位点是在细胞壁结合结构域，这可能有助于去除错误折叠的蛋白质，确保S层具有完整功能。

1.3Cwp66 Cwp66属于黏附因子蛋白，其功能区在菌株之间同源性较低，其C-末端结构域表面暴露并且在菌株之间高度可变，而N-末端结构域是保守的并且锚定在细胞壁中，该基因的缺失导致细胞黏附能力，细胞运动性和应力耐受性的降低[13]。在Cwp66正常表达水平情况下，抗Cwp66抗体不能降低艰难类梭菌在Vero细胞的黏附率，但菌体经60 ℃热处理后，与抗Cwp66抗体孵育使得菌体的黏附能力降低，这表明抗Cwp66抗体对于艰难类梭菌黏附抑制存在特异性，即只对特定结构有作用，或是热处理可引起CD细菌表面蛋白质构象的改变或断裂，从而使Cwp66的黏附结构暴露可以与相应抗体结合。cwp66突变体还表现出比野生株对克林霉素，氨苄青霉素和红霉素更敏感，但与野生株相比对万古霉素和甲硝唑的耐药性更高。

1.4CwpV(Cell Wall Binding V) CwpV存在于所有艰难类梭菌中，是CWPs中含量最多的蛋白。通过SecA2系统分泌到细胞表面，切割产生两个肽段，按其相对分子质量不同，可将CwpV分为五种类型。CwpV可以介导细胞聚集，其过度表达会导致菌落变小、密集，反之会导致菌落增大、稀疏。CwpV还介导了具有相位可变性的噬菌体抗性，即当该酶基因转录时才能防止噬菌体的侵袭。这种相性变化是由于位于cwpV基因和启动子之间的5′非翻译区中存在一个表观遗传开关。在正常生长条件下，大多数细菌(95%)在开关内形成了一个不依赖Rho的转录终止器，防止下游cwpV基因的转录，处于“关闭”状态，而在5%的细胞中，一个特定位点(RecV)的特异性酪氨酸重组酶催化了基因开关的反转，从而破坏了转录终止子，并允许转录cwpV基因。但在艰难类梭菌流行株R20291中引入φCD38-2噬菌体后，95%的细胞表达该基因，但驱动相位变化的信号以及φCD38-2对这种调节功能的影响机制还需进一步研究[14]。而且有研究发现，尽管CwpV具有噬菌体抗性，噬菌体仍可以与细菌结合，但是在菌体中不能检测到噬菌体DNA复制，这可能是由于CwpV通过干扰噬菌体DNA合成从而抵抗噬菌体侵袭。

1.5Cwp2和Cwp8 Cwp2(Cell Wall Binding 2)可通过低pH甘氨酸或溶菌酶等试剂提取，相对分子质量约为66 000，具有高度的免疫原性，但由于Cwp2在部分菌株中不表达，因此其相应抗体在这类菌株引起的CDI防治中不能发挥作用[5]。在仓鼠模型中，敲除艰难类梭菌cwp2基因对于菌株的生长、芽孢形成和引起CDI的能力没有影响，但却导致了TcdA水平增加，可能是与毒素表达有关的转录因子改变导致毒素表达增加，也可能是由于从S层去除Cwp2可能会导致细胞完整性下降而释放增加，或两者皆有。同时也表现出对Caco-2细胞的黏附能力受损，表明Cwp2作为黏附素的潜在作用。

Cwp8是一种功能区域与Cwp2高度相似的S层蛋白，每个CBW2图案都承担着拓扑异构体-初级酶的折叠，它们一起组装成一个三叶草状结构。基于蛋白质之间的相似性，推测其很可能也具有黏附性质[15]。总之，S层蛋白是艰难类梭菌表面最丰富的蛋白，大多由同源基因编码，其功能包含黏附、切割、免疫等，与艰难类梭菌的生长繁殖紧密相关，也是免疫疗法的重要潜在靶点，对S层蛋白的进一步研究对开发新疗法具有重要意义。

2 鞭毛蛋白

2.1鞭毛的结构 除RT078型外，艰难类梭菌的多数型别都具有鞭毛结构。鞭毛结构包括分子马达、钩-基体复合体和旋转丝状体[16]。鞭毛是细菌毒力构成的一部分，通过以下几方面参与致病：①促进对宿主细胞的黏附；②提供动力摄取营养物质；③促进生物膜的形成；④促进毒力因子跨细胞膜的转移，属于特殊III型分泌系统；⑤作为免疫调节剂，通过Toll样受体5(TLR5)信号通路触发促炎细胞因子。鞭毛结构由多种蛋白组成，目前已经在艰难类梭菌630和R20291菌株中已鉴定出多种控制鞭毛结构完整性和运动的基因和蛋白质，这些蛋白参与多项生物功能。控制CD630菌株鞭毛组装的基因包括三个不同的操纵子，称为F1、F2和F3调节子。F1区域编码的鞭毛蛋白FliC和FliD的是形成完整功能鞭毛所必需的结构蛋白，艰难类梭菌FliC和FliD基因突变会导致艰难类梭菌鞭毛缺失且没有动力。其中，FliC与毒素基因表达、细菌定植和毒力有关，并负责体内感染过程中的多效性基因调控[17]。实验证明，与枯草芽孢杆菌类似，艰难类梭菌FliC由鞭毛组装因子(FliW)和碳储存调节剂A(CsrA)共同调节，CsrA负向调节fliC表达，而FliW通过抑制CsrA转录后调控间接影响FliC表达。

2.2鞭毛对毒力的影响 除运动和黏附外，鞭毛还可影响艰难类梭菌的毒力作用，且表现出相位变异性[11]。这种表型异质性是通过DNA重组酶RecV通过位点特异性重组实现的相位变化实现的，与CwpV类似，在鞭毛基因flgB的上游，存在一个154bp的编码“开关”，当两者在同一个方向上，flgB基因表达升高，表现为鞭毛的生物合成、游泳运动和毒素产生，反之，flgB操作子转录降低，细菌表现为无鞭毛，无运动能力，毒素水平降低。Dominika Trzilova等在研究中证实Rho因子是影响艰难类梭菌重要毒力因子相位变化的基因表达调节器[18]。

2.3鞭毛的免疫学功能 多项研究表明，FliC和FliD由于其保守性和诱导强烈免疫反应的能力，是与合适的佐剂一起用于疫苗的良好候选者。因此，有研究在计算机上利用PEPSCAN程序计算和预测鞭毛蛋白中适合免疫疗法的抗原表位。FliC的两个抗原表位中，117QRMRTLS123位于鞭毛内的TLR5结合区，可被患者的抗体所识别。但其显示出与其他有鞭毛菌株免疫兔血清的高水平的交叉反应，能否成为合适的疫苗研发靶标还需进一步研究。另一个抗原表位是205MSKAG209，其位置暴露，易与抗体所结合[19]。FliD是一种高度保守的蛋白，具有鞭毛帽的功能。FliD同样有两个表位受到研究人员的关注，即分别位于“头部”和“腿部”区域的226NKVAS230和306TTKKPKD312，该区域高度灵活，可能参与蛋白寡聚。这些区域定位的重要性以及它们在功能性鞭毛组装方面的功能需要进一步研究。综上，鞭毛蛋白在不同型别艰难类梭菌的黏附、运动和毒力中显示了不同的影响。CD630菌株的黏附对鞭毛的依赖要低于R20291，而不同的鞭毛基因对毒素基因的调节也存在差异，鞭毛对艰难类梭菌的调节复杂且涉及到多个方面，还需要进一步的研究探讨。

3 菌毛蛋白

菌毛也是一种广泛存在于原核生物中的表面蛋白，在许多种属中都存在。菌毛蛋白通常介导表面运动、细菌与宿主细胞和/或其他细菌的黏附以及生物膜形成[20]。在艰难类梭菌中，菌毛基因表达可促进其自动聚集，有助于CD630/630△erm和R20291形成生物膜，且该过程受c-di-GMP调节。本实验室在探讨艰难类梭菌不同型别表面蛋白表达差异的研究中，通过生物素标记提取膜蛋白并进行LC-MS/MS质谱分析显示，RT027型菌株中存在特异的菌毛蛋白，而这种蛋白在RT017型菌株中未检测到。值得注意的是，RT027与RT017具有不同的毒素表型和流行特点，RT027是欧美地区的主要流行菌株，而RT017(即ST37型菌株)是亚洲地区的优势菌株。这两种不同型别菌株的表面蛋白的差异可能与其特殊的致病性和流行性有关。

4 其他蛋白

4.1分选酶锚定蛋白 在许多革兰阳性细菌中，表面蛋白通过分选酶的作用共价附着在细胞壁上。目前，已经有学者对革兰阳性菌中具有不同功能的六个分选酶家族进行了研究，所有这些家族都识别不同的底物基序[21]。在艰难类梭菌中只发现了一个功能性的分选酶基因--CD2718。胶原结合蛋白CD2831和黏附素CD3246都通过分选酶附着到细胞壁上，并通过高度特异的蛋白酶PPEP-1(Zmp1/CD2830)的释放。PPEP-1突变菌株在仓鼠感染模型中毒力明显降低，表明其在黏附素相关调节中的重要性，并表明PPEP-1可作为潜在的抗菌药物靶标。

4.2纤维连接蛋白 除了CWP家族和分选酶底物外，CD的许多其他表面蛋白可以通过与细胞膜的相互作用或通过某种未知结合机制定位于细胞表面。纤维连接蛋白结合蛋白(Fbp68/FbpA)属于MSCRAMM家族，能够与纤维连接蛋白和Vero细胞结合。Fbp68可能与艰难类梭菌的黏附定植有关，在感染小鼠模型中，Fbp68突变株在盲肠的定植率明显降低。但与野生株相比，对Caco-2或HT29-MTX细胞黏附率没有明显差异。其在黏附定植过程中的作用还需进一步研究。此外，有研究发现CDI患者血清中含有抗Fbp68抗体，表明Fbp68可能是艰难类梭菌免疫疗法的潜在靶标[11]。

4.3热休克蛋白 热刺激、低pH溶液和缺铁均可以增加艰难类梭菌对组织细胞的黏附。GroEL是Hsp(heat shock protein)60伴侣蛋白家族的一员，它会在上述刺激反应中表达增加。艰难类梭菌与抗GroEL抗体共同孵育后，菌体在Vero细胞的黏附率显著降低，也表明GroEL具有黏附功能。

综上所述，艰难类梭菌表面蛋白对于艰难类梭菌的生存与感染致病极为重要，它不仅直接与宿主细胞相互作用，介导黏附定植和免疫反应，还影响细菌的毒素表达和代谢过程，是潜在的抗菌药物作用靶标。S层蛋白作为艰难类梭菌主要的膜蛋白，包含多种类型和功能，是维持细菌生存的重要工具，也是治疗CDI的重要突破点。鞭毛蛋白和菌毛蛋白是细菌重要的运动黏附器官，并影响了艰难类梭菌的毒力作用。种类丰富且功能复杂的表面蛋白的研究将进一步阐明艰难类梭菌致病机制，并有助于开发疫苗和治疗艰难类梭菌相关疾病的新疗法。