外泌体在肝癌耐药中的研究进展

2022-11-24 06:34张尧雨杨淑琳综述宋小天审校

河北医科大学学报 2022年8期

张尧雨，杨淑琳(综述)，魏林，宋小天(审校)

(河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北石家庄 050017)

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是世界范围内发病率排名第六，病死率排名第三的恶性肿瘤。肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌最常见的类型，占75%～85%[1-2]。近年来，分子靶向药物和免疫疗法在肝癌治疗上取得了快速进展，但由于复发和远处转移以及对抗肿瘤药物的耐药性，肝癌患者的五年总生存率仍不容乐观[3]。外泌体作为细胞间信息交流的重要媒介，与肿瘤的发生发展及耐药性密切相关。现就外泌体在肝癌耐药中的作用方式进行阐述，以深入探讨肝癌耐药的相关机制，对指导临床合理用药及寻找新的干预措施具有重要的指导意义。

1 外泌体的发现

外泌体是由细胞通过多囊泡体与细胞膜融合而分泌的40～200 nm的膜包裹囊泡，最初在绵羊网织红细胞中被发现，后来被命名为外泌体。外泌体来源于几乎所有类型的细胞，并存在于各种体液中，其功能也依赖于来源的细胞类型。TSG101、分化抗原(cluster of differentiation，CD)81、CD63、CD9是其表面的特异性标记物[4-5]。近年来由于其在细胞间信息交流、信号转导、免疫调节和药物传递等方面的作用而备受关注[6]。目前，外泌体的分离方法有差速超速离心法、磁珠分离法、微流体法、超滤法、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法等。差速超速离心法是外泌体分离方法的“金标准”，但该方法需要昂贵的仪器，且获得的外泌体浓度和纯度较低。外泌体含有多种生物活性分子，包括核酸、蛋白质和脂质等，这些信息物质可以包裹在外泌体中被细胞分泌到微环境中。受体细胞可以通过直接融合、内吞或直接与其表面标志物融合摄取外泌体，通过其携带的信息物质调节受体细胞的生物学活性，从而参与机体免疫应答、免疫调节、肿瘤侵袭和药物传递等生物学过程[7]。

2 外泌体与肝癌的发生发展

从“种子与土壤”假说到今天，人们对肿瘤的研究不仅局限于肿瘤细胞本身，而是更加关注于肿瘤细胞所处的微环境。肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)是高度异质性的，在功能失调的环境(缺氧等条件)下，可导致血管网络和信号通路异常，TME中的细胞通过细胞间连接、自分泌和旁分泌相互作用进而促进肿瘤的发生、发展、转移和耐药[8]。其中，旁分泌因子包括细胞因子(cytokines，CK)、趋化因子(chemokines)和外泌体，现在被认为是占主导地位的生物因子。近年来，多项研究发现外泌体在促进肝癌发生发展中具有重要作用[9]。研究表明，许多的外泌体非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)参与了肝癌进展过程，非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA，如微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)等。比如肝癌细胞分泌的miR-103可以靶向多个内皮连接蛋白，增加血管通透性，促进肿瘤转移[10]。肿瘤相关成纤维细胞外泌体miR-320a的缺失与肝癌的增殖和转移密切相关[11]。高转移性肝癌细胞分泌外泌体miR-1247-3p，直接靶向B4GALT3蛋白，导致成纤维细胞中整合素β1-NF-κB信号通路激活，激活的肿瘤相关成纤维细胞通过分泌白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)等促炎细胞因子，促进肝癌进展及转移[12]。外泌体是上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的重要介质，可将癌细胞转化为更具侵袭性的表型。肝癌细胞来源的外泌体miR92a-3p通过抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)和激活Akt/Snail信号通路在促进EMT进展和肝癌转移中起着关键作用[13]。外泌体也可通过介导免疫抑制环境来促进肿瘤进展。例如肝癌细胞分泌外泌体赖氨酰氧化酶样蛋白4(recombinant lysyl oxidase like protein 4，LOXL4)，一方面可以招募更多的浸润的巨噬细胞，另一方面，可以调节巨噬细胞呈递抑制性检查点分子细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)，削弱细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的免疫监视，促进肿瘤细胞的免疫逃避，导致肝癌的发生[14]。

3 外泌体与肝癌耐药

传统上，肿瘤耐药机制包括肿瘤细胞中抗凋亡蛋白的过度表达、药物外排泵的过度表达、药物作用靶点的突变、信号通路改变等。肝癌是实体瘤中最典型的耐药肿瘤，可过表达二氢嘧啶脱氢酶、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和多药耐药(multiple drug resistance，MDR)基因。除了这些已被充分研究的机制外，外泌体诱导的肿瘤耐药已成为一种新的机制被研究者们广泛关注[15]。大量研究表明，外泌体可抵抗许多分子靶向药物和免疫治疗方案，包括索拉非尼，免疫检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂联合靶向治疗等。索拉非尼是美国食品药品监督管理局(Food And Drug Administration,FDA)批准的第一个用于治疗晚期肝癌的一线药物，是一种作用于丝氨酸/苏氨酸激酶和受体酪氨酸激酶的多激酶抑制剂。免疫检查点抑制剂是免疫疗法中应用最为广泛的方法，主要分为两大类，一类是以程序性死亡受体1(programmed cell death protein1，PD-1)为代表的抑制剂，另一类是激活剂，激活剂目前还处于临床研究阶段。

外泌体中药物外排泵的存在与耐药密切相关，可能是外泌体中存在的P-gp和ATP结合盒蛋白(ATP-binding cassette protein，ABC protein)转运体家族成员介导药物在这些小泡中主动隔离。ABC转运体家族成员的过度表达曾被广泛认为是肿瘤细胞多药耐药的重要因素，其介导的药物外排泵作用是肿瘤发生耐药的重要原因之一。有人认为，药物刺激可促进外泌体的产生从而加速药物外排，或许会成为一种新的耐药机制。外泌体可能通过调节ABC转运体家族成员的表达而促进肝癌耐药。研究表明，在索拉非尼、喜树碱和阿霉素等抗肿瘤药物作用下，肝癌细胞来源的外泌体高表达lnc-VLDLR，显著上调ABCG2(ATP结合盒、G亚家族成员2)的表达，从而加快药物外排、消除肝癌细胞的药物反应和敏感性导致耐药[16]。另外，耐药细胞中的某些物质可通过外泌体转移至药物敏感(受体)细胞，使其获得多药耐药的表型。例如外泌体circRNA-SORE和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)。研究认为circRNA-SORE通过外泌体促进肝癌细胞对索拉非尼耐药[17]。circRNA-SORE在索拉非尼耐药肝癌细胞中表达上调，药物敏感细胞在过表达circRNA-SORE后也获得了耐药性。沉默circRNA-SORE则可以显著增强药物诱导的肿瘤细胞凋亡。另一项研究显示，高度侵袭性肝癌细胞来源的外泌体可诱导其他肝癌细胞产生索拉非尼耐药性[18]。其机制是外泌体中HGF增多，通过激活HGF/c-Met/Akt途径抑制细胞凋亡，促进肿瘤生长，进而促进肝癌细胞对索拉非尼耐药。

虽然EMT被公认为是癌症转移的关键介质，但最近的研究显示，其对于肿瘤的治疗耐药性也是至关重要的。目前EMT促进耐药性的详细机制尚不清楚，但可能归因于间充质状态、特定转录因子和相关信号级联的失调等。对于耐药性的影响，最近的一项研究表明，耐药肝癌细胞分泌的外泌体以EMT依赖的方式“培养”敏感细胞成为多药耐药细胞[19]。来自耐药肝癌细胞的外泌体可以将致癌的miR-32-5p转移至药物敏感细胞，导致药物敏感细胞中PTEN水平显著降低，从而触发PI3K/Akt/mTOR通路的激活，并通过调节血管生成和EMT诱导多药耐药(5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、吉西他滨和索拉非尼)的发生。然而，持续使用外泌体分泌抑制剂GW4869，导致外泌体miR-32-5p减少，EMT逆转，最终抑制了5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、吉西他滨和索拉非尼的耐药性。此进一步确定了肝癌组织中外泌体miR-32-5p水平与EMT发生耐药的相关性。

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是肝癌细胞的一个亚群，具有很强的自我更新、分化和成瘤能力。越来越多的证据表明，干细胞对肝癌的许多治疗手段都具有抗性。干细胞的干性相关基因，包括上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、CD133、CD90等在耐药肝癌细胞中高度表达。因此，干细胞被认为是促成肝癌耐药性的关键因素。基于此，TME中的外泌体内容物可以通过引发干细胞特性来参与治疗耐药。对于肝细胞癌，索拉非尼治疗的肝癌细胞和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)均可以富集外泌体lnc-ROR，一方面通过抑制抑癌基因p53依赖的信号转导途径诱导耐药，另一方面通过扩增CD133+干细胞群减少索拉非尼诱导的肝癌细胞死亡。进一步敲低lnc-ROR则可增强索拉非尼诱导的肝癌细胞死亡，同时减少了 CD133+的干细胞，这些结果表明外泌体lnc-ROR是驱动肝癌干细胞诱导治疗耐药性的基础[20]。

免疫治疗被认为是晚期肝癌的一种有前途的治疗方法，但仍有相当比例肝癌患者无反应甚至出现耐药。外泌体除了在肝癌的靶向药物治疗中参与耐药的发生，其在免疫治疗中也存在着促进耐药的现象。最近一项研究表明外泌体circUHRF1可促进肝癌的免疫逃逸(immune evasion)，阻断PD-1抗体治疗[21]。其原因可能是肝癌细胞来源的外泌体circUHRF1抑制了自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)细胞来源的干扰素γ(interferon-gamma，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)的分泌。此外，circUHRF1也可通过降解miR-449c-5p上调T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)的表达，抑制NK的杀伤功能，从而促进肝癌的免疫逃逸和对PD-1抗体治疗的抵抗。因此，抑制circUHRF1有可能成为肝癌患者的治疗靶点。

4 外泌体在肝癌耐药治疗中的作用

目前，常用的药物递送系统有脂质体和聚合物纳米颗粒(nanoparticles，NPs)。这两种给药系统已被用于递送不同类型的药物分子，包括抗癌药物、抗真菌药物和镇痛药等。然而，脂质体制剂因无法承受剪切压力、温度、酸碱度或稀释剂浓度的变化，且无法精确地输送到体内的特定位置限制了它的使用[22]。聚合物纳米颗粒比脂质体系统具有更好的稳定性，但它们的生物相容性和潜在的安全性仍有待进一步研究。随着外泌体的深入研究，人们发现外泌体或外泌体模拟物拥有高效的货物运输功能，具有理想药物传递系统的许多特征，如循环半衰期长、靶向组织能力强、生物相容性好，没有内在毒性等。这似乎是一种更好的选择，能克服大多数脂质体或聚合物药物传递系统的局限性。许多文献表明，外泌体给药系统可以应用到肿瘤的治疗中[23-24]。

众所周知，干细胞疗法已用于治疗或预防疾病多年。在已上市的干细胞产品中应用最多的就是间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。并且在已知的产生外泌体的细胞类型中，人类间充质干细胞是产量最高的细胞。最近一项研究表明将miR-122包裹到脂肪组织来源的间充质干细胞分泌的外泌体中，通过诱导细胞凋亡和细胞周期停滞有效地增强了肝癌的治疗敏感性[25]。此外，瘤内注射外泌体miR-122可显著增强索拉非尼对肝癌的体内抗肿瘤作用，这为肝癌患者的治疗提供了新的策略。同样，siGRP78修饰的骨髓间充质干细胞外泌体能敏化索拉非尼耐药的肝癌细胞，抑制细胞外基质的降解，进而抑制肿瘤的进展，并逆转其耐药性。并且外泌体siGRP78在体内外均可以抑制肝癌生长和侵袭[26]。也有越来越多的证据表明，外泌性miRNA参与肝癌耐药治疗。如Wang等[27]用富含miR-744的外泌体处理肝癌细胞，通过抑制PAX2蛋白的表达抑制了肝癌细胞的增殖，并增强了肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性。Semaan等[28]用富含miR-214的人脑内皮细胞衍生的外泌体联合抗癌剂(奥沙利铂或索拉非尼)治疗肝癌，与单独使用抗癌剂相比，显著降低了肝癌细胞的生存力和侵袭力，其机制是miR-214降低了肝癌细胞P-gp蛋白和SF3B3蛋白的表达，P-gp和SF3B3是广为人知的可以促进肝癌化疗耐药性和癌细胞增殖的两种蛋白。该联合治疗对肝癌细胞具有靶向性，机体内正常组织和细胞不受影响。之前的研究报道过，索拉非尼诱导耐药是通过增强PD-L1的表达和调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)的比例，进一步在原位肝癌模型中诱导了免疫抑制。最近有研究表示外泌体联合免疫疗法可以增强索拉非尼的疗效。这是由于外泌体减少了Tregs的数量，增加了CTL细胞的数量，但单独使用外泌体或PD-1抗体则效果不明显[29]。

由于外泌体介导了肝癌治疗耐药，因此可能会成为预测肝癌耐药的一种潜在的非侵入性生物标志物。肝癌患者血清中存在着许多外泌体miRNA、lncRNA、circRNA，可通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)或酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行定量检测，对治疗反应较差的肝癌患者有较好的临床应用前景。通过抑制外泌体的生物发生或抑制外泌体输出抗药性物质是可行的。尽管外泌体在肝癌方面的相关工作较少，但已经在其他肿瘤开展了下一步的研究。靶向外泌体极有可能是逆转肝癌耐药性的一项候选策略。

5 展望