PI3K/AKT信号通路介导脂联素对脑缺血再灌注大鼠的保护作用

何俊芳，刘新平，吕学海，王斌

脑缺血再灌注损伤的机制可能涉及炎症、凋亡、氧化应激和细胞自噬等[1]。脂联素是脂肪细胞产生的一种可与细胞外基质相互作用的细胞因子，具有抗动脉粥样硬化、抗炎和抗氧化应激等作用[2]。有研究发现，高血压和脑梗死患者体内血浆脂联素水平显著低于正常人群，认为脂联素对脑缺血再灌注具有保护作用[3]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信号通路是细胞内关键的信号传导途径之一。动物实验发现，脂联素预处理可激活PI3K/PKB信号通路，改善大鼠心肌缺血，使用PI3K抑制剂LY294002干预处理可抑制脂联素对大鼠心肌缺血的改善作用[4]。

本研究通过建立大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血再灌注模型大鼠并给予脂联素治疗或PI3K抑制剂处理，旨在探究脂联素对大鼠脑梗死的作用机制，以期为脑梗死防治提供基础实验依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物建模与分组 雄性健康SD大鼠，体质量250～280 g，适应性喂养7 d。造模手术前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，采用右侧颈内动脉（internal carotid artery，ICA）线栓法结扎方法制备MCAO缺血再灌注模型。颈前正中切口后逐层分离，暴露出右颈总动脉、颈外动脉和右侧ICA，然后将18 mm单股3～0号尼龙线插入右侧ICA并结扎，缺血1.5 h后移除尼龙线实现再灌注。将血流仪的探针固定于大鼠颅骨平面，当检测显示大鼠的脑血流量恢复至基线水平表示缺血再灌注成功，则可以缝合切口。待大鼠自然苏醒后，根据Longa 5分法评估MACO缺血再灌注造模大鼠成功与否[5]。0分：正常；1分：无法伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：无法自发行走，意识丧失。1～3分表示建模成功，剔除0和4分的大鼠。

本研究将大鼠分为①假手术组：大鼠接受皮肤切口处理，但是不进行尼龙线插入ICA和结扎，其余操作相同，然后给予大鼠尾静脉注射0.9%生理盐水（0.09 mL/100 g）；②模型组：大鼠缺血再灌注2 h后，给予尾静脉注射0.9%生理盐水（0.09 mL/100 g）；③脂联素治疗组：采用0.9%生理盐水溶液将脂联素（美国Phoenix公司，批号426002）稀释至2 mg/mL，大鼠缺血再灌注2 h后，按照大鼠体质量一次性给予尾静脉注射脂联素（180 μg/100 g）；④PI3K/PKB抑制剂（LY294002，美国Sigma公司，HY-10108）组：大鼠缺血再灌注2 h后，按照大鼠体质量一次性给予尾静脉注射脂联素（180 μg/100 g）+LY294004（0.03 mg/100 g）。以上每组15只大鼠。

大鼠脑缺血再灌注24 h后根据Longa 5分法再次进行脑神经功能评分。检测完神经功能评分后麻醉大鼠，快速断头取脑，-20 ℃冷冻处理30 min，剥离脑壳后分离脑组织。每组取5只用于脑梗死面积测定，5只用于脑含水量测定，剩余5只大鼠的脑组织与生理盐水混合破碎制成组织混液，用于PI3K、PKB、磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated PKB，p-PKB）和脂联素蛋白表达水平的测定和炎症因子血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平的测定。

1.2 脑梗死面积和脑含水量测定 将大鼠的脑组织从额极向后做连续冠状切片（5片），再将脑片置入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）中温浴30 min。染色结果白色为梗死灶，红色为正常脑组织。染色后，将脑切片在4%多聚甲醛中固定，采用Image J软件计算梗死面积，计算公式为：（缺血区面积/脑片面积）×100%。脑组织含水量检测：每组取5只大鼠的脑组织，去掉嗅球、小脑和低位脑干，称量为大脑湿质量，烘烤72 h后称量为干质量。脑含水量（%）=[（湿质量-干质量）／湿质量]×100%。

1.3 PI3K、PKB、p-PKB和脂联素蛋白表达水平测定 各组分别各取5只大鼠脑组织混液各2 mL，加入1 μL裂解液，将组织混液离心处理（4 ℃，12 000 r/min，20 min），取上清液通过聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白质测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）定量样品浓度。采用12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，随后再电泳转移至聚乙烯基氟化物膜，经过5%的牛血清蛋白室温封闭1 h，然后与兔单克隆抗体PI3K（1∶1000）、兔多克隆抗体PKB（1∶1000）、兔多克隆抗体p-PKB（1∶1000）、兔单克隆抗体脂联素（1∶1000）和兔单克隆抗体甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1000）一抗在4 ℃下孵育过夜处理。将膜用洗涤缓冲液洗涤5次/分，然后与辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG二抗（1∶2000）在室温下孵育1 h，然后成像并使用Image J软件对蛋白质条带进行分析，以灰度值表示。GAPDH用作内部对照，PKB作为p-PKB的比值对照。

1.4 脑组织炎症因子MDA和SOD水平测定各组分别取5只大鼠的脑组织混液2 m L，3000 r/min离心10 min取上清液，采用SOD检测试剂盒（南京建成生物技术研究所）和MDA检测试剂盒（南京建成生物技术研究所）分别检测SOD和MDA水平。取10 μL上清样品和40 μL稀释液于微孔酶标板中，每孔分别加入100 μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体，封孔后37 ℃水浴温育60 min，去液后洗涤5次。然后每孔加入50 μL底物贮备液稀释液（1∶200稀释），37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加入50 μL终止液，MDA测定450 nm波长的OD值，SOD测定550 nm波长OD值。

1.5 统计方法 采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，正态分布的计量资料用表示，多组间分析比较采用单因素方差检验，两组内再采用最小显著差异检验（LSD-t）。非正态分布数据采用M（P25～P75）进行统计描述，采用非参数检验进行组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积、脑含水量和神经功能的影响 各组大鼠脑梗死面积、脑含水量和神经功能缺损评分的整体差异均有统计学意义（均P＜0.001）。与假手术组相比，模型组、脂联素治疗组、抑制剂组的脑梗死面积、脑含水量和神经功能缺损评分均升高（均P＜0.001）；与模型组比较，脂联素治疗组大鼠的脑梗死面积、脑含水量和神经功能缺损评分均降低（均P＜0.001），抑制剂组大鼠的脑梗死面积（P=0.292）、脑含水量（P=0.145）和神经功能缺损评分（P=0.406）差异无统计学意义；与脂联素治疗组比较，抑制剂组大鼠的脑梗死面积、脑含水量和神经功能缺损评分均升高（均P＜0.001）（表1）。

表1 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积、脑含水量、神经功能缺损的影响

2.2 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑组织脂联素蛋白表达水平的影响 假手术组、模型组、脂联素治疗组和抑制剂组大鼠脑组织脂联素蛋白表达水平分别为0.95±0.03、0.73±0.07、0.92±0.04和0.81±0.03，组间整体差异有统计学意义（F=23.69，P＜0.001）。与假手术组相比，模型组和抑制剂组的脑组织脂联素蛋白水平降低（均P＜0.001），脂联素治疗组的脑组织脂联素蛋白水平差异无统计学意义（P=0.318）；与模型组比较，脂联素治疗组的脑组织脂联素蛋白水平升高（P＜0.001）；与脂联素治疗组比较，抑制剂组的脑组织脂联素蛋白水平降低（P=0.002）（图1）。

图1 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑组织脂联素蛋白表达水平的影响

2.3 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑组织PI3K/PKB信号通路的影响 各组大鼠脑组织中PI3K（F=25.58，P＜0.001）和p-PKB蛋白（F=17.68，P＜0.001）相对表达水平整体差异有统计学意义。与假手术组相比，模型组大鼠的脑组织PI3K（0.73±0.05vs. 0.93±0.03，P＜0.001）和p-PKB（0.82±0.05vs. 0.97±0.04，P＜0.001）蛋白表达水平均降低，抑制剂组大鼠的脑组织PI3K（0.75±0.04vs. 0.93±0.03，P＜0.001）和p-PKB（0.81±0.04vs. 0.97±0.04，P＜0.0 01）蛋白表达水平也均降低；与模型组比较，脂联素治疗组大鼠的脑组织PI3K（0.89±0.05vs. 0.73±0.05，P＜0.001）和p-PKB（0.94±0.03vs. 0.82±0.05，P＜0.0 01）蛋白表达水平均升高；与脂联素治疗组比较，抑制剂大鼠的脑组织PI3K（0.75±0.04vs. 0.89±0.05，P＜0.001）和p-PKB（0.81±0.04vs. 0.94±0.03，P＜0.001）蛋白表达水平均降低（图2）。

图2 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑组织PI3K/PKB信号通路的影响

2.4 脂联素对脑缺血再灌注大鼠氧化应激的影响 各组大鼠脑组织中SOD和MDA水平整体差异均有统计学意义（均P＜0.001）。与假手术组比较，模型组、脂联素治疗组和抑制剂组的脑组织中SOD水平降低（均P＜0.001），MDA水平升高（均P＜0.001）；与模型组比较，脂联素治疗组大鼠的脑组织中SOD水平升高（P＜0.001），MDA水平降低（P＜0.001），抑制剂组大鼠的脑组织中SOD（P=0.065）和MDA（P=0.161）水平差异无统计学意义；与脂联素治疗组比较，抑制剂组大鼠的脑组织中SOD水平降低（P＜0.001），MDA水平升高（P＜0.001）。具体数据见表2。

表2 脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑氧化应激的影响

3 讨论

脑缺血过程中氧化应激反应加剧，可能导致自由基氧化产物（如MDA）水平的升高，以及抗氧化产物（SOD等）水平的降低[6]。过量自由基的产生会导致机体微环境内自由基和抗氧化物的动态平衡被破坏，进而会加剧炎症反应和呼吸链等一系列生理反应的破坏。

本研究中MCAO大鼠的脑组织坏死，脑水肿明显，同时出现明显的神经功能缺损。在反映氧化应激的指标上，MCAO大鼠脑组织内自由基氧化产物MDA水平升高，而对应的抗氧化产物SOD水平降低。当MCAO大鼠接受脂联素治疗后，其脑组织损伤和氧化应激反应的各项指标均得到显著改善，接近于假手术组大鼠的生理水平，说明脂联素对脑缺血再灌注损伤可能存在一定的治疗和改善作用。有研究也显示脂联素对急性脑缺血再灌注大鼠具有一定的神经保护作用，与本研究结果类似[7]。

脂联素是一种对机体有保护作用的脂肪因子。近期有研究发现，脂联素与肥胖、高血压、糖尿病和心脑血管等疾病密切相关，可减轻动脉粥样硬化病变，在抗炎、抗糖尿病和抗动脉粥样方面均显示出了良好的潜力[8]。有研究显示，脑梗死后脂联素水平降低，且与不稳定动脉粥样硬化斑块形成有关[9]。还有研究显示，脂联素基因敲除的MCAO大鼠表现出脑梗死面积和心肌细胞凋亡增加，而当大鼠体内过表达脂联素时，其脑缺血再灌注损伤相应降低[10]。白浩等[11]的研究显示，经脂联素处理后，脑缺血再灌注小鼠的脑梗死面积减少、神经功能改善，同时其脑水肿程度和细胞凋亡情况也均得到改善。本研究中，经脂联素治疗处理的脑缺血再灌注大鼠的脑梗死面积、脑水肿、神经功能缺损均显著降低，而脂联素水平升高。这进一步证实了脂联素在脑缺血再灌注中的抗损伤作用。

PI3K/PKB通路是维持细胞生存的重要信号通路系统。PI3K/PKB可通过减轻细胞凋亡、氧化应激和炎症反应进而改善脑缺血再灌注损伤。有研究发现，PI3K/PKB信号通路对缺血动物模型有保护作用[8]。还有研究显示脂联素可通过激活PI3K/PKB信号通路改善心肌缺血大鼠的心肌损伤[9-10]。p-PKB是PKB磷酸化的形式，在PI3K/PKB途径中，p-PKB是一种活化蛋白形式，也是发挥蛋白作用的形式，p-PKB/PKB通路激活的程度主要体现于PKB蛋白中被活化后p-PKB蛋白的含量。本研究中，经过脂联素治疗的脑缺血再灌注大鼠，其脑组织中PI3K和p-PKB蛋白表达水平均升高，提示PI3K/PKB信号通路被激活。对应的，脂联素治疗组大鼠脑损伤减轻，神经功能改善，同时抗氧化产物SOD水平升高，反映体内氧化应激反应改善，提示脂联素与PI3K/PKB信号通路在改善大鼠缺血再灌注损伤过程中存在相互关系。本研究抑制剂组采用PI3K/PKB信号通路抑制剂LY294002处理，可以逆转脂联素对脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤和神经功能改善的作用。这也间接证明PI3K/PKB信号通路在改善脑缺血再灌注大鼠脑损伤中的积极作用。

综上所述，本研究通过构建MCAO脑缺血再灌注大鼠模型，采用脂联素治疗处理，显著改善了大鼠的脑损伤情况，说明脂联素对脑缺血再灌注有明显保护作用，且该保护机制可能与激活PI3K/PKB信号通路从而抑制氧化应激有关。但本研究存在一定的不足，如脂联素治疗大鼠后，对其细胞生理层面的变化没有进行探索，这是后续研究需要关注的重点。

【点睛】本研究对MCAO脑缺血再灌注模型大鼠进行脂联素治疗和PI3K/PKB通路抑制剂LY294002干预，发现脂联素可以减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，其可能通过激活PI3K/PKB通路发挥神经保护作用。