扇贝裙边糖胺聚糖体外抗HSV-2病毒的实验研究

于囡,韩建建,刘赛

(1 青岛市第八人民医院科研科,山东 青岛 266121； 2 青岛市中心医院急诊科； 3 青岛大学药学院)

单纯疱疹病毒2型(HSV-2)属于α疱疹病毒类型，为线性双链DNA病毒，该病毒引起的生殖器疱疹越来越受到关注，严重影响了人类公共卫生健康[1-3]。同时研究表明，HSV-2感染者感染人类免疫缺陷病毒的概率也会大大增加[4]。目前临床上常用的抗 HSV 药物有阿昔洛韦、喷昔洛韦等[5-6]，但随着耐药株的出现，寻找具有对抗 HSV 活性的新药物极其重要[7]。近年来，关于海洋多糖的研究及开发利用成为研究热点[8-11]。扇贝裙边糖胺聚糖 (SS-GAG)是从青岛渤海湾栉孔扇贝裙边中提取、纯化得到的酸性黏多糖 (即硫酸多糖)，又称为氨基多糖，其红外线光谱图与透明质酸较为接近[12]。海洋多糖具有多种药理活性，包括抗凝血[13-14]、抗粥样硬化[15-18]、抗病毒[19-21]、增强免疫[22]、抗肿瘤[23]等作用。目前尚未有关于SS-GAG的抗HSV-2作用的文献报道。本实验将首次在细胞水平上探讨SS-GAG对HSV-2的抗病毒作用，以期为临床治疗疱疹提供依据以及为海洋多糖药物的研发提供新的思路。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1试剂与仪器 SS-GAG为青岛大学药学院扇贝多糖课题组采用酶解、醇沉、精制的方法提取分离并干燥的粉末制剂，实验时应用无血清DMEM培养液配制成不同浓度的溶液。细胞生长液为含体积分数0.10胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液，细胞生长维持液为含体积分数0.02 FBS的高糖DMEM培养液。试剂二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)为Sigma公司产品。DMEM干粉培养基以及FBS为上海生工生物工程股份有限公司产品。ELx 800型酶联免疫检测仪购自美国BioTek公司；TC2323型CO2培养箱购自美国Forma Scientific公司；超净工作台购自苏净集团安泰公司；XDP-1型倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.1.2细胞株及病毒株 非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和标准HSV-2病毒，均由青岛大学微生物与病原生物学教研室友情惠赠。病毒在Vero细胞中传代培养，-80 ℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1病毒毒力测定[24-25]将Vero细胞以每孔2×104个的密度接种于96孔板，于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养过夜，弃去原培养液，加入梯度稀释的HSV-2病毒液(10-9～10-1)，吸附2 h后更换细胞生长维持液继续培养。每天通过倒置显微镜观察细胞病变情况(CPE)。当CPE达50%以上计为病变孔，记录病变程度和孔数，待细胞病变稳定后判定结果。根据Reed-Muench方法计算病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50)，以其表示病毒毒力。

1.2.2药物对细胞毒性测定 将Vero细胞悬液稀释成108/L接种于无菌96孔板，置37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养36 h，弃去原培养液，换为含有不同浓度SS-GAG(50、100、200、400、800、1 600 mg/L)的维持液,每个浓度设6个复孔，另设正常细胞对照组(正常对照组)。置37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养72 h。通过倒置显微镜观察细胞CPE。细胞培养结束前4 h，每孔加入20 μL的MTT，当孔内出现甲瓒结晶时，弃去MTT染液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀后在酶联仪570 nm波长处测定每孔吸光度(A值),并计算Vero细胞存活率。公式如下：Vero细胞存活率(%)=SS-GAG组平均A值/正常对照组平均A值×100%，以其反映SS-GAG对Vero细胞增殖活性的影响。

1.2.4SS-GAG 对HSV-2感染Vero细胞后效应的抑制作用[26]将100 TCID50的HSV-2病毒液接种到单层Vero细胞孔中(每孔100 μL)，37 ℃吸附2 h,弃病毒液换含不同浓度SS-GAG(50、100、200 mg/L)的维持液(每孔200 μL)，继续培养72 h,每日在倒置显微镜下观察CPE并记录结果。分组同1.2.3。当病毒对照组细胞病变达75%以上时,采用MTT法测定各组细胞A值，并分别计算各组SS-GAG抗病毒有效率(ER)。ER=(SS-GAG组平均A值-病毒对照组平均A值)/病毒对照组的平均A值×100%。

1.2.5SS-GAG对HSV-2的综合作用 将100 TCID50的HSV-2病毒液与含不同浓度的SS-GAG(50、100、200 mg/L)维持液等量混合后直接接种到单层Vero细胞孔中(每孔200 μL)，37 ℃吸附2 h,弃上清液，加入含有原浓度的SS-GAG的维持液继续培养72 h,每日在倒置显微镜下观察CPE并记录结果。分组同1.2.3。测定方法以及ER计算方法同1.2.4。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 病毒毒力测定

按照Reed-Muench方法测得病毒的TCID50为10-4.2/100 μL。实验用病毒浓度为100 TCID50。

2.2 药物对细胞毒性测定

结果显示，正常Vero细胞呈梭形，细胞膜完整且边界清晰；经SS-GAG处理过的细胞形态规则，排列紧密有序，无脱落、融合等现象发生,与正常细胞的形态无明显差别。同时MTT检测结果也显示，SS-GAG各浓度组细胞增殖活性与正常对照组差异无显著性 (P>0.05)，表明SS-GAG在100～1 600 mg/L浓度范围内对Vero细胞无毒性作用。见表1。

表1 不同浓度的 SS-GAG对细胞活性的影响

2.3 SS-GAG对HSV-2的直接影响

经不同浓度的SS-GAG预先与HSV-2混合后再感染Vero细胞，各组细胞均出现了典型的CPE特征，表现为细胞肿胀、细胞间融合、碎裂等。MTT检测结果显示，不同浓度SS-GAG组细胞增殖活性与病毒对照组差异无显著性(P>0.05)。以上结果提示SS-GAG没有直接灭活HSV-2病毒的活性。见表2。

表2 SS-GAG对 HSV-2的直接作用

2.4 SS-GAG对HSV-2感染Vero细胞后效应的抑制作用

结果显示，与正常对照组细胞比较，病毒对照组细胞出现了典型的CPE特征，细胞增殖活性明显减弱(q=7.42，P<0.01)。与病毒对照组相比,SS-GAG各组CPE特征明显减弱，细胞活性随着药物浓度增加而增强(F=20.061，P<0.01),药物对病毒的抑制作用有效率达46.8%以上。以上结果提示SS-GAG能明显抑制HSV-2的复制，抗病毒活性呈现剂量依赖性。见表3。

2.5 SS-GAG对HSV-2的综合作用

结果显示，与正常对照组细胞比较，病毒对照组细胞出现典型的CPE特征，细胞增殖活性明显低于正常对照组细胞(q=7.38，P<0.01)。与病毒对照组相比较,SS-GAG各组均能有效地保护感染的细胞,使细胞活性增强(F=39.947，P<0.01)，而且随着药物浓度的增加，SS-GAG抗病毒有效率逐渐增加。其中浓度为200 mg/L的SS-GAG抗病毒有效率达到51.2%。见表3。

表3 SS-GAG对HSV-2复制和综合作用的影响

3 讨 论

HSV病毒为嗜神经性的有包膜双链DNA病毒，分为2个血清型，即HSV-1和HSV-2。HSV-2主要通过性行为传播，多数生殖器疱疹由HSV-2病毒引起。SS-GAG是扇贝多糖课题组人员从青岛渤海湾栉孔扇贝裙边中提取纯化的硫酸多糖成分，其与肝素的理化性质相似[27-28]。课题组前期已经初步对SS-GAG抗HSV-1活性进行了体内外实验，结果表明SS-GAG具有抗HSV-1的活性[22]。本研究是通过建立HSV-2在Vero细胞上的病毒感染模型，采用CPE观察法结合MTT法来评价SS-GAG对HSV-2的抗病毒活性，通过SS-GAG对病毒的直接影响、抑制作用和综合作用等3种方式来初步探讨其作用机制。本文实验结果表明，SS-GAG对HSV-2没有直接杀伤作用，但对HSV-2感染有抑制作用,而且随着药物浓度的增加其抑制作用也增强，因此可推测其抗病毒作用可能与干扰HSV-2病毒复制有关。

病毒在细胞内复制是复杂但又程序化的过程，影响复制循环中任一环节均可能起到抗病毒作用。SS-GAG在多种作用方式下均可发挥不同程度的抗病毒活性[25]，可作为多途径、多靶点药物进行开发研究。至于本实验中的SS-GAG通过何种机制阻断病毒感染细胞并抑制病毒的复制，尚有待进一步研究和观察。