β地中海贫血患者1 331例出生年份及基因突变类型分析*

何圆圆, 李平萍, 李瑶芸, 曾丽红, 吴国波, 周雪花, 唐卒卒, 肖彬, 周天红, 王丽, 张新华△

中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院 1血液科， 2检验科， 3儿科， 4输血科(广西南宁 530021)

广西是地中海贫血(以下简称地贫)高发区[1-2]，长期以来广西地贫胎儿出生率高，地贫患者生存状况差[3-4]。2010年广西政府启动了“广西地贫防治计划”，目的是降低重型地贫胎儿的出生率、改善已出生患者生存状况，2018年广西政府提出了“重症地贫零出生目标”。在地贫防控流程中，找出地贫高危孕妇是关键，即胎儿可能是重型地贫的孕妇，在孕妇都检出地贫基因型后就可以达到目的。然而，α地贫很容易通过检出的基因型区分重型(--/--)和中间型(--/-α或--/αTα)[1]，而β地贫却很难区分，过去常认为β0/β0基因型为重型β地贫(TM)，β+/β+基因型为中间型β地贫(TI)，而β0/β+基因型既可以是TM也可以是TI[1]，但是大量的研究表明临床结局常常与此不相符[5-9]。2013年国际地贫联合会(TF)将地贫分类为输血依赖型地贫(TDT)和非输血依赖型地贫(NTDT)，并分别编辑出版了相应的诊疗指南[10-11]，按指南标准过去以基因型判断的中间型α地贫和TI中的部分患者是TDT，但出生前是无法确定的，而未来地贫防控关注的重点除了孕中晚期或出生后即死亡的重型α地贫外就是TDT。另外，部分TDT患者尽管临床可诊断地贫但常规基因分析无法明确基因诊断，而他们的父母均有一方没查出地贫基因而进入地贫防控的盲区。通过回顾性分析我院就诊的1 331例广西籍β地贫患者出生年份及基因突变类型特点，探讨地贫防控策略的效果及走向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年1月至2020年12月期间在我院就诊资料完整的广西籍β地贫患者1 331例，其中男781例，女550例，年龄1～65岁，中位年龄12岁。本研究已通过中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院伦理委员会批准。

1.2 方法 以血常规、血红蛋白电泳及地贫基因分析结果进行诊断，诊断标准参照《血液病诊断及疗效标准》[12]。以身份证或户口本确定出生地和出生年份。地贫基因型结果以三甲及以上医院或第三方检验平台做的地贫基因分析报告单为依据，均以国家卫生计生委妇幼司、国卫妇幼出防便函[2014]106号和国家卫健委妇幼健康司、国卫办妇幼函[2018]683号批准的地贫试剂盒检测，地贫试剂盒不能检出的基因突变类型采纳第三方检测平台测序结果(不同年代所用测序方式不同，从一代测序到三代测序)。临床、血常规和电泳结果提示为TM或TI，但常规试剂盒检测仅诊断为β地贫杂合子的，经骨髓细胞学分析确定为溶血性贫血骨髓像的均作为有“罕见基因突变类型”。常规试剂盒仅能检出23种基因型，包括：3种常见缺失型α地贫基因：--SEA、-α3.7和-α4.2；3种常见突变型α地贫基因：αCS、αQS和αWS及17种常见β地贫基因：CD41-42(-TCTT)，IVS-Ⅱ-654(C→T)，-28(A →G)，CD71-72(+A)，CD17(A→T)，βE(CD26G→A)，CD31(-C)，CD43(G→T)，-32(C→A)，CD27-28(+C)，-29(A→G)，-30(T→C)，CD14-15(+G)，CAP+40-+43(-AAAC)，Int(ATG→AGG)，IVS-Ⅰ-1(G→T)和 IVS-Ⅰ-5(G→C)。

2 结果

2.1 出生年份 1 331例患者中1987年出生的为10例，此前均为个位数，此后逐年增加，2009年达到顶峰为103例，2010年开始下降，2018年降至18例，2020年降至2例。见图1。

图1 1 331例β地贫患者出生年份分布

2.2 基因突变类型 1 293例(97.15%)通过常规基因分析明确基因型，检出12种基因突变类型，常见基因突变类型的分布频率见表1。38例(2.85%)罕见基因突变类型患者26例通过测序明确基因型，12例未能明确基因型(按当时测序结果，没有进行新的测序)，检出8种β地贫基因突类型和2种α三联体，见表2。1 293例常见基因突变类型β地贫中最常见的4种基因型是CD41-42/CD17(205例，15.9%)、CD41-42/CD41-42(197例，15.2%)、CD41-42/-28(96例，7.4%)和CD17/CD17(92例，7.1%)。1 293例患者中β0/β0纯合子344例(26.6%)，β0/β0双重杂合子380例(29.4%)，β0/β+双重杂合子370例(28.6%)，β+/β+纯合子22例(1.7%，其中14例-28/-28，8例IVS-Ⅱ-654/IVS-Ⅱ-654)，β+/β+双重杂合子31例(2.4%，其中25例IVS-Ⅱ-654/-28，4例29/-28，2例IVS-Ⅱ-654/-29)，β/HbE 146例(11.3%)。有176例患者复合了α地贫(13.6%)。

表1 1 293例患者常见β地贫基因突变类型的分布频率

表2 通过测序检出的8种β-地贫罕见基因突变类型和2种α三联体

3 讨论

β地贫致病的核心机制是α/β珠蛋白链的不平衡[1，13]。由于α/β珠蛋白链比例失衡，过多的α珠蛋白在红细胞前体中积聚并沉淀形成四聚体，沉积在红细胞膜上，引发血色素分解和游离Fe3+释放，后者可催化活性氧反应并降低还原型谷胱苷肽，导致膜蛋白氧化，引发膜损伤，加上四聚体沉积所引发的自体免疫清除机制，促使成熟红细胞形成脆性增加和可塑性降低的“地贫样红细胞”，此类细胞易于在微循环中破裂而产生溶血[13]。此外，虽然造血旺盛，但重型和中间型β地贫患者的红系祖细胞大多数在髓内死亡，导致无效造血[13]。无效造血反而促进骨髓造血的代偿性增加，造血腔扩大，出现骨骼畸形，骨质疏松，形成地贫面容，严重者出现病理性骨折，还引起脾脏增大，相应的脾脏破坏红细胞增加，加重贫血[10-11，13]。无效造血时还将促使机体增加铁吸收，导致铁过载，过量的铁沉积于肝脏、心脏、胰腺、甲状腺、性腺等部位，导致肝功能不全、心功能不全、糖尿病、生长发育迟缓、第二性征推迟等并发症[10-11]。β地贫的治疗主要是规范输血和足量除铁，造血干细胞移植是目前唯一根治的手段，而血源紧张和治疗费高昂是地贫患者生存的障碍，做好地贫防控，减少重症地贫胎儿出生是关键。

1 331例β地贫患者的出生年份分布显示过去广西地贫患者生存状况差，大多在幼儿时期死亡[3]，而随着经济条件和医疗条件的改善，地贫患者生存状况得到改善[4]，特别是2010年“广西地贫防治计划”实施后地贫患者生存状况进一步改善[14]，同时由于防控工作成效显著，重症地贫胎儿出生率大幅度下降[15]。2018年广西政府提出了“重症地贫零出生目标”，零出生指标是：重型地贫胎儿诊断率≥98%，重型地贫胎儿医学干预率≥98%，重型地贫患儿出生率<0.3/万。按广西地贫流调结果以每年70万孕妇估算广西每年出生的TM和TI胎儿约为724 例(95%CI： 603～897)[2]，从图1可见2009年当年全广西出生的TM和TI患者中约有1/7(103例)来过我院就诊，而2009年就是最高值，从2010年起快速减少，2018年是18例，2020年仅2例。从桂妇儿健康服务信息管理系统获悉2020年广西助产机构活胎产数为57.49万例，按重型地贫零出生目标计算当年TM患儿出生例数应<17例，而当年出生的TM患儿中有2例到我院就诊，如果按广西1/7的TM和TI患者会到我院就诊估算是达标了，但需要注意是广西各地医院在实施地贫防治计划后高度重视地贫防治工作，地贫诊疗水平显著提高，来我院就诊的TM和TI患者也相应减少，我院就诊患者量已难以准确反映广西TM和TI患者的实际出生人数。

1 331例β地贫患者中1 293例患者明确基因型，最常见的4个基因型是CD41-42/CD17、CD41-42/CD41-42、CD41-42/-28和CD17/CD17，与流调结果一致。38例(2.85%)临床诊断TM或TI的患者中通过常规基因分析没有明确基因诊断的，通过测序有26例明确了基因型，测序检出8种β地贫基因突类型和2种α三联体，可见地贫防控精准度有必要进一步提高。38例患者中多数是父母做地贫筛查时一方没检出地贫基因而漏诊。目前国家卫生计生委妇幼司、国家卫妇幼出防便函[2014]106号和国家卫健委妇幼健康司、国卫办妇幼函[2018]683号批准的地贫试剂盒只检测我国最常见的23种基因型，而在中国人群中已发现129种β珠蛋白基因点突变(含异常血红蛋白)和16种β地贫缺失突变[13]。

有研究通过高通量测序(二代基因测序，NGS)对10 111对夫妇进行地贫分子筛选分析中，共检测到4 180对携带4 840个突变等位基因的个体，并确定了186对有可能影响后代的夫妇，发现与传统筛查比较，可以将高风险夫妇的阳性检出率提高23.2%[16]。而NGS技术也有不能明确的罕见基因，NGS技术在实际应用中也存在缺陷，如读长较短，无法跨越基因上串联重复区域，导致其在检测串联重复区域时存在明显不足[17]。与NGS技术相比，地贫等位基因综合分析(CATSA)的三代测序(TGS)方法用于识别α和β地贫遗传携带者状态有更大的优势，针对此项技术的全国多中心研究结果已有报道[18]，其发现TGS结合远程聚合酶链式反应(PCR)的技术对于地贫等位基因的覆盖率、可靠性和准确性，提供了一种全面的方法，有可能为地贫基因携带者筛查提供一种通用的解决方案，实现对地贫基因携带者的精准诊断，避免在地贫产前诊断及临床诊断方面出现漏诊。本研究3例α三联体为TGS技术检出。

“广西地贫防治计划”更多关注的是重型地贫的医学干预，β0/β0胎儿是TM需要在知情同意前提下终止妊娠，β0/β+患者可以是TM也可以是TI[1，19-20]，无法判断出生后是TM还是TI，也需要在知情同意前提下终止妊娠，而认为β+/β+胎儿是TI[1，19-20]，所以无需进行医学干预，另外理论上β地贫复合α地贫的患者贫血会有所减轻[1，19-20]，会认为复合α地贫的β0/β+是TI，无需进行医学干预。然而大量的研究证明，由于存在着基因修饰因子的修饰作用，临床上基因型与表型可能不一致，例如BCL11A、HBSIL、MYB、KLF1[5-9]等修饰基因都可能会影响到β地贫的表型。本研究患者中5例是β0/β+复合东南亚缺失，却仍然是TDT。另外，本研究患者中β+/β+纯合子有53例(4.1%)，此类胎儿如何处置有必要达成共识，如果还按现在的防控策略让β+/β+地贫胎儿继续妊娠(或β+/β+孕妇无需产前诊断)会有产生一部分TDT患者。

目前的地贫防控策略非常明细，需要各个环节的医务人员认真落实，早孕建卡检测是防控的最后一环，如果确定孕妇夫妇一方携带地贫基因，产科医生务必结合血常规中的平均红细胞体积、血红蛋白电泳中的HbA2和地贫基因检测3个结果一起分析，三者不相符时务必进行认真分析，必要时送测序，避免漏诊。随着二代或三代测序技术水平的提高和检测试剂盒成本的降低，二代或三代测序技术进入地贫防控策略是必然的，这将会显著降低漏诊率，显著提高工作效率。

利益相关声明：不存在竞争经济利益。

作者贡献说明：李平萍、李瑶芸、曾丽红、吴国波、周雪花、唐卒卒、肖彬、周天红、王丽负责资料收集、分类管理、数据整理；何圆圆、张新华负责方案设计、数椐分析统计和论文撰写。