经肾动脉移植不同剂量骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠肾脏炎症的影响*

李嘉琦, 李天祎, 夏春娟, 杨素萍, 张娅, 王家平△

1昆明医科大学第二附属医院放射科(云南昆明 650106)； 2昆明医科大学第三附属医院放射科(云南昆明 650118)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是一种复杂的进行性疾病，近年来CKD患病率逐年上升，全球一般人群患病率已高达14.3%，CKD目前已成为影响全球约10%人口的重要公共卫生问题[1]。从轻、中度肾脏疾病发展为终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)是一个及其复杂的过程，其中涉及许多因素，包括小管间质性炎症和纤维化等。近年来研究表明，持续的炎症与CKD的发生、发展之间存在密切关系[2]。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在骨髓中的成体细胞，具有多向分化潜能、无免疫排斥、可自体移植等良好的细胞特性，研究表明BMSCs具有促进慢性肾损伤修复的潜能，是再生医学中用于修复损伤组织和脏器的一种优秀种子细胞[3-4]。已有研究证实BMSCs能增强肾脏应对多种急性损伤信号的能力，在促进肾脏修复方面起到显著作用[5]。目前对于BMSCs传统移植方式主要包括以下几种：静脉途径移植、动脉途径移植、局部注射。研究发现不同途径移植BMSCs可影响其治疗效果，课题组前期研究发现在阿霉素慢性肾病大鼠模型中经肾动脉途径移植BMSCs效果优于经尾静脉途径。虽然目前已有一些关于BMSCs有效性的研究，但是对于移植剂量，尚未形成标准，一些研究设计了高低计量的对照试验，但大剂量干细胞输注可能造成局部栓塞的风险。2021年3—9月，我们通过对大鼠多次低剂量注射阿霉素建立CKD模型，通过介入方法经肾动脉途径对CKD大鼠移植不同剂量BMSCs，通过观察不同剂量干细胞修复受损肾脏以及减轻炎症反应能力，探讨干细胞输注剂量对肾脏炎症的影响，以期为干细胞治疗CKD提供新的思路及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 于昆明医科大学实验动物中心购入65只6周龄健康清洁级雄性SD大鼠，其中2只4周龄用于提供BMSCs。购入美国Gibco公司胎牛血清(FBS)、低糖培养基(L-DMEM)、PBS缓冲液；购入Sigma公司阿霉素；购入HE染色试剂盒、青链霉素双抗和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司)；购入CD3、CD20单克隆抗体(Abcam公司)。相应实验经由昆明医科大学动物实验伦理审查委员会通过(kmmu2020273)。

1.2 BMSCs体外分离培养 2只健康4周龄雄性SD大鼠腹腔注射水合氯醛后脱颈处死，于75%酒精中浸泡5 min后取股骨、胫骨，按照以往经验分离培养BMSCs[6]，用相差倒置显微镜观察细胞形态及生长方式，取P3代细胞进行成骨、成脂诱导分化培养，流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。鉴定合格后取P4代细胞用PBS缓冲液洗涤3次后配成浓度为1×106个/mL、2×106个/mL、3×106个/mL的溶液，1 mL EP管置于-20℃冰箱保存备用。

1.3 模型构建及实验分组 大鼠购入后给予充足食物与水，适宜温度下饲养2周。51只大鼠通过尾静脉直接注射阿霉素方法造模，为防止尾静脉注射阿霉素因组织液外导致尾巴腐烂，课题组采用李爱平等[7]方法，以酒精、热水浸泡大鼠尾巴，使尾静脉充分膨胀后，注射器回抽有血、注射无阻力再行注入，首次剂量为4 mg/kg，间隔1周后，第2次注射剂量为2 mg/kg[8]，本实验7周左右成模，成模期间2只大鼠因为严重腹泻死亡，一只因尾部溃烂感染死亡，最后存活48只。参考杨扬[9]方法以血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白升高，取肾切片行苏木精-伊红染色(HE染色)光镜观察符合CKD改变为成功。造模成功后将大鼠随机分为模型组(M组)、低剂量组(A组)、中剂量组(B组)、高剂量组(C组)，每组12只，另外取12只作正常对照组(N组)。A、B、C组参照陆发承等[10]方法通过介入途径经肾动脉移植BMSCs 0.5 mL，浓度分别为1×106个/mL、2×106个/mL、3×106个/mL，M组经肾动脉输注等量PBS，N组经尾静脉输注等量0.9% NaCl，术后14 d，处死各组大鼠，取肾组织备用。

1.4 主要观察指标 观察各组大鼠一般情况，如毛发、精神状态、体重改变等。分别于BMSCs移植后第7、14天，将各组大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，尾静脉采血，通过全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平。14 d末处死大鼠，迅速取出右肾剔除包膜，0.9%NaCl冲洗，甲醛固定、乙醛脱水、石蜡包埋后5 μm连续切片，行HE染色光学显微镜下观察肾脏结构病理改变，免疫组化染色观察CD3、CD20表达情况。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 N组大鼠精神状态良好，反应灵敏，皮毛有光泽；阿霉素造模后大鼠精神萎靡不振，毛发粗糙无光泽，食欲变差，蜷缩弓背，体重减轻。经肾动脉移植BMSCs后，A、B、C组大鼠食欲较前改善，体重增加，但各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 移植BMSCs后各组大鼠体重比较

2.2 BMSCs移植治疗结果 与N组相比，M组、A组、B组、C组血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白均显著升高(P<0.05)。BMSCs移植7、14 d后，A组、B组、C组与M组比较血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白降低(P<0.05)，且B、C组低于A组，但两组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 BMSCs移植后各组大鼠血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白比较

2.3 免疫组化结果 N组大鼠中CD3、CD20未见或微量表达，M组CD3在大量肾小管上皮细胞以及肾间质中呈强阳性或阳性表达，CD20在肾间质中呈强阳性表达，部分肾小球中呈阳性表达。A组、B组、C组大鼠肾间质CD3、CD20表达较M组表达减轻，其中B、C组减轻更为明显。见图1。

图1 各组大鼠CD3、CD20免疫组化染色结果(×200)

2.4 大鼠肾脏病理结果 N组HE染色未见明显病理改变，肾小球血管袢薄且清晰，肾小管形态正常；M组肾小球部分见空泡变性，系膜细胞和基质见不同增生，部分肾小球毛细血管襻受压闭塞，部分肾小管管腔扩张，小管上皮细胞肿胀，肾间质可见大量炎症细胞浸润；A组、B组、C组可见肾小球不同程度萎缩，肾小管间质可见少量轻-中度淋巴细胞、浆细胞浸润并伴有结缔组织增生，其中B、C组病理学形态较A组轻微。见图2。

图2 各组大鼠肾组织HE染色结果(×200)

3 讨论

近年来，已有一些相关研究发现BMSCs对CKD具有良好的治疗效果[11-13]。但是在移植剂量上却没有形成统一标准，为探寻肾损伤炎症修复程度与移植剂量的关系，本实验设置了低、中、高剂量组。关于输注途径，目前主要有经静脉途径、经动脉途径以及器官内直接注射几大类。龚勇泉等[14]发现BMSCs可以减轻心脏移植排斥反应，且动脉途径优于静脉途径和心肌局部注射途径。夏勇等[15]研究发现静脉移植干细胞更有益于改善糖尿病的整体代谢情况。穆丽雅等[16]发现在小鼠急性肝损伤模型中，BMSCs促进肝脏修复的程度与移植途径无关。不同学者研究得出的结果不同。一般来说，实验动物体积均较小，对其而言，通过手术进行器官直接注射干细胞，对其创伤较大，易增加感染及死亡风险，静脉途径相较于动脉途径有着不可避免的肺循环过程，这一过程减少了干细胞归巢数量，虽然部分研究结果未展示出动脉途径输注的良好效果，但不排除与其所选择的干细胞种类、输注剂量、动物模型以及造模方法有关，所以本实验采用动脉注射途径去验证其有效性。本实验相较于传统开腹直视下注射干细胞，其创新性为通过介入微创方法超选择性经肾动脉输注BMSCs，避免了传统操作方法可能所导致的不良后果如：因实验动物体型过小造成穿刺时肾动脉撕裂、肾动脉术后狭窄等情况。

目前研究认为，持续性无菌性炎症是CKD的重要标志和临床特征。一些学者认为随着肾功能的下降，体内的活性氧自由基会逐渐增多，从而促使免疫细胞不断激活并释放大量炎症因子，使机体长期处于一个“微炎症状态”。而这种长期的氧化应激反应会进一步促使多个脏器损伤，尤其是对于肾脏，主要表现为炎症因子的表达、聚集，加速肾脏纤维化，从而导致疾病的进一步发展[17-18]。近年来炎症因子对肾间质的损害受到了众多学者的关注，其与肾脏疾病的发生发展息息相关。张春雷等[19]研究发现在IgA 肾病患者中检测炎症因子可以用来检测肾损伤程度，炎症损伤与疾病的进展有着密切的关系。Matoba等[20]研究发现炎症因子的产生在启动糖尿病肾损伤中起关键作用。因此通过检测炎症因子的表达情况，可以一定程度上为判断患者疾病严重程度以及给予针对性治疗提供参考。目前国内外学者主要通过免疫组织化学法来测定肾组织中细胞膜表面的具有特异性标识的分化抗原簇(cluster of differentiation，CD)来反映肾组织中免疫分子的表达程度，从而间接反映肾脏损害严重程度。近年来CD分子通过不同致病途径参与肾脏疾病的进展已经得到了证实，其中又以 CD3、CD20 的研究较多。

CD3、CD20分别作为成熟T淋巴细胞、B淋巴细胞表面特征性的标志之一，通过评估其表达程度，可以一定程度上评估肾组织炎症严重程度[21]。因此，本研究拟通过采用免疫组织化学法测定肾组织中具有特异性标识的分化抗原簇判断疾病的严重程度。

本实验通过对比经肾动脉途径移植不同剂量BMSCs治疗CKD大鼠，BMSCs移植7、14 d后，治疗组大鼠一般情况得到明显改善，其中大剂量对于体重的改善更为明显。研究结果显示不同剂量BMSCs均可对受损的肾功能起到修复作用，生化结果示：BMSCs移植后第7、14天，A组、B组、C组与M组相比，血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白均降低(P<0.05)，且B组、C组降低程度优于A组，但两组之间差异无统计学意义(P>0.05)；免疫组化结果示：M组、A、B、C组CD3、CD20均呈阳性或强阳性表达，A、B、C组较M组表达减轻，其中B、C组减轻更明显。此外HE染色结果示：移植组炎性细胞表达减少，萎缩肾小球数量减少，肾小管一定程度上扩张。本实验中对照组肾组织中也检测出微量CD分子，这些分子的存在可能与信息递呈、组织修复等相关，CD分子在模型组中显著表达，进一步验证了其可能参与肾脏的损害，疾病的进展，本实验发现随着肾脏病理损伤严重程度的增加，CD分子表达也随之增加，二者间存在一定的相关性，提示CD分子阳性表达程度对评判肾脏损害程度具有较高价值。实验中随着细胞移植剂量的提升并未呈现出有利于治疗的量效关系，推测可能由于细胞浓度过高，移植后器官内脉管系统栓塞所导致，以上表明在治疗肾损伤引起的炎症反应时可能需要适宜的细胞数量，其具体原因需后续实验进一步探究。

综上所述，经肾动脉移植BMSCs疗法可通过抑制炎症反应缓解CKD大鼠肾功能损伤，其可能是通过降低CD分子表达所实现，且此疗效与移植数量有关，在观察时限内，移植较大剂量BMSCs组效果优于小剂量组。目前应用干细胞进行疾病治疗，部分学者研究的方向在于探讨不同浓度的干细胞对于疾病的治疗效果。但随着医学的不断发展，个体化精准治疗的优势逐渐展现出来，所以在今后应用BMSCs治疗CKD时，如果根据移植者自身情况定制个体化方案，在其耐受的情况下，尽量减少并发症发生率的同时移植适宜浓度的BMSCs或者考虑按照公斤体重进行移植相信会取得更好的疗效。

利益相关声明：所有作者共同认可文章无利益冲突。

作者贡献说明：李嘉琦负责数据整理、统计分析、论文撰写；李天祎、夏春娟负责论文审阅与修改；杨素萍、张娅负责方案执行与实施；王家平负责研究设计与方案指导。