刺参AIF-1的原核表达、抗血清制备及表达

王 丽 君， 王 凤 鑫， 王 晗

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

刺参(Stichopusjaponicus)属棘皮动物门海参纲，具有较高的营养价值[1]。但刺参仅具有天然免疫功能[2]，养殖过程中，致病微生物和寄生虫的感染时有发生。目前，研究者已经对刺参的免疫功能进行了大量的研究[3-4]。但是，目前针对刺参蛋白的抗血清较少，成为在蛋白水平上深入研究相关反应过程及机理的阻碍之一。

同种异体移植炎症因子-1(Allograft inflammatory factor-1，AIF-1)具有参与损伤、炎症反应等生物学功能[5-7]，人[8]、鼠[9]等脊椎动物和海绵、海参[10]、海胆[11]、牡蛎[12-13]等无脊椎动物中均存在该基因。在刺参体壁、肠道、呼吸树、体腔细胞以及纵肌等组织细胞中已检测到转录水平的表达[9]。但是，目前关于刺参AIF-1抗体/抗血清制备的研究尚未见报道。制备刺参AIF-1抗血清，将为在蛋白水平分析刺参应激反应和免疫功能提供有益的研究工具。

本实验应用原核表达系统对刺参AIF-1进行重组表达及纯化，并免疫小鼠获得较高效价的小鼠抗刺参AIF-1抗血清，可以应用于蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测。分析了灿烂弧菌体腔注射后，刺参体腔细胞和呼吸树组织AIF-1转录水平和蛋白水平表达的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠，大连医科大学动物实验中心；刺参，大连海参养殖场；Trizol，生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白Marker，北京全式金生物技术有限公司；五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂，北京索莱宝科技有限公司；PrimeScriptTM ⅡcDNA第一链合成试剂盒，TB Green©Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)定量PCR试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；anti-β-actin一抗，美国Proteintech公司；HRP-二抗/FITC-二抗，美国Santa Cruze生物公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪 器

电泳仪，美国Bio-rad公司；转膜仪，北京六一生物科技有限公司；酶标仪，Thermo Fisher公司；PCR反应扩增仪(T100)，美国Bio-rad公司；荧光定量PCR仪，罗氏LightCycler480 Ⅱ；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；倒置荧光显微镜，OLYMPUS公司。

1.3 方 法

1.3.1AIF-1基因的扩增及载体构建

采用Trizol法提取刺参呼吸树总RNA，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，使用RT-PCR技术，分别依据编码区上下游序列设计引物。上游引物5′-ATGCCTGGAAGTAAACTGGAC-3′；下游引物5′-GGAACCAAATGTGGAATGTCC-3′扩增AIF-1基因，凝胶电泳检测PCR产物。由宝生物(大连)公司完成PCR产物测序，上海生工生物公司完成基因的体外合成及表达载体pET-29b(+)-AIF-1-his的构建。利用热休克技术将表达载体pET-29b(+)-AIF-1-his转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。

1.3.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定

将重组大肠杆菌BL21接种到卡那霉素液体选择性培养基，进一步扩大培养至OD6000.6左右。分别用0.25和0.50 mmol/L IPTG于20 ℃诱导表达16～20 h。4 ℃离心收集菌体，按1∶5的质量体积比加入裂解液、蛋白酶抑制剂和溶菌酶，于冰水浴超声破碎。

1.3.3 表达产物的纯化

采用镍离子螯和层析法纯化重组目的蛋白，洗脱液为50 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaH2PO4和300 mmol/L NaCl。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，SDS-PAGE分析蛋白纯化效果。

1.3.4 鼠抗AIF-1抗血清的制备

应用纯化的AIF-1重组蛋白，1∶1混合5周标准鼠单抗/多抗制备佐剂对小鼠进行小腿免疫注射，每只鼠20 μg蛋白，3周后进行再次免疫，5周后取血清即为抗血清。

1.3.5 间接酶联免疫吸附检测

采用间接ELISA分析血清效价。抗原包被、洗板、封闭后，加入按比例梯度稀释的抗血清孵育，通过羊抗鼠二抗(HRP-IgG)孵育，显色，终止反应。在450 nm处测定吸光度，计算阴性对照组血清的A450平均值，以抗血清的A450大于等于阴性对照组的2.1倍时对应的抗血清稀释倍数作为效价。

1.3.6 蛋白免疫印迹检测

提取刺参呼吸树等组织蛋白，SDS-PAGE检测后，电转移至PVDF膜上。经封闭，抗血清孵育，二抗(HRP-IgG)孵育，应用增强化学发光法检测膜上的阳性条带。

1.3.7 细胞免疫荧光检测

通过细胞免疫荧光法检测体腔细胞AIF-1的表达。细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻底平皿，经固定、透膜、封闭、抗血清封闭、二抗(FITC-IgG)孵育，Hoechst33342复染细胞核后，荧光显微镜下观察细胞AIF-1的表达。

1.3.8 灿烂弧菌体腔注射

灿烂弧菌(本实验室保藏)在NB液体培养基中180 r/min、30 ℃培养。离心收集菌体后重悬于过滤海水中。每头刺参体腔注射100 μL菌液(1.0×107CFU/mL)，注射过滤海水刺参为对照组。8 h后提取体腔细胞和呼吸树组织RNA，荧光定量PCR分析AIF-1转录水平的变化。24 h后提取体腔细胞和呼吸树组织蛋白样品，蛋白免疫印迹分析AIF-1蛋白表达水平变化。

1.3.9 荧光定量PCR

提取总RNA经逆转录合成cDNA，以此为模板，进行荧光定量PCR分析(SYBR Green法)。刺参内参基因(细胞色素b)上游引物qCytb-F：TGAGCCGCAACAGTAATC；下游引物qCytb-R：AAGGGAAAAGGAAGTGAAAG。刺参AIF-1基因上游引物：qAIF-1-F：GTCGTTGCCAATGGTGAT；下游引物：qAIF-1-R：TGCCAGAGTTGTTCGTGT。mRNA相对表达量以体腔细胞内参基因Cytb表达水平为100%。

1.3.10 统计学分析

应用Student’s假设检验分析组间差异，P<0.05显著性差异(n=3)。

2 结果与讨论

2.1 AIF-1基因扩增的鉴定

如图1所示，PCR产物经琼脂糖电泳分析，可见预期大小的产物片段。PCR扩增产物与GenBank中KC708869序列一致，后续实验依据该序列的氨基酸顺序体外合成重组蛋白。

图1 凝胶电泳检测AIF-1基因扩增

2.2 目的蛋白的诱导表达鉴定

经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析菌体裂解液上清中不同分子质量蛋白表达的变化。从图2中可以看出，1～4号出现分子质量约为17 ku的蛋白条带，与目的蛋白AIF-1的分子质量一致。而对照组(空载体)未检测到该分子质量的蛋白，提示该条带应为IPTG诱导后表达重组蛋白AIF-1。

M，Marker；1～4，诱导后的菌体裂解液上清；5，对照组

2.3 表达产物的纯化结果

菌体裂解液上清采用镍离子亲和层析，通过SDS-PAGE检测纯化结果。从图3中可以看出，洗脱后样品在17 ku处出现明显的单一条带，未检测到杂蛋白带，表明纯化效果好，可以应用于免疫动物制备抗血清。

M，Marker；1，经IPTG诱导的菌体裂解液；2，洗脱液1；3，洗脱液2

2.4 间接酶联免疫吸附检测结果

如图4所示，鼠抗AIF-1抗血清效价为1∶102 400。提示制备的血清具有较高的效价，有利于其在免疫实验中的应用。

图4 间接ELISA法分析抗血清效价

2.5 蛋白免疫印迹检测结果

以制备的抗血清为一抗，应用蛋白免疫印迹技术分析刺参呼吸树组织和体腔细胞中AIF-1蛋白的表达。如图5所示，刺参呼吸树组织和体腔细胞均检测到AIF-1蛋白的表达。提示制备的抗血清可以应用于蛋白免疫印迹技术，用于刺参组织中内源表达的蛋白样品的检测。

1，呼吸树组织蛋白；2，体腔细胞蛋白

2.6 细胞免疫荧光检测

以制备的抗血清为一抗，应用细胞免疫荧光技术分析体腔细胞AIF-1蛋白的表达，结果如图6所示。从图6可以看到，检测到AIF-1蛋白表达阳性的体腔细胞(绿色)，提示制备的抗血清可以用于AIF-1蛋白在细胞原位表达的检测。

绿色，AIF-1阳性细胞；蓝色，Hoechst 33342染色后的细胞核

2.7 灿烂弧菌免疫刺激后AIF-1转录水平和蛋白水平表达的变化

灿烂弧菌是刺参常见的致病菌，应用灿烂弧菌体腔注射，分析免疫刺激后刺参AIF-1转录水平和蛋白水平的表达，结果如图7所示。荧光定量PCR结果显示，灿烂弧菌体腔注射能够显著上调呼吸树组织和体腔细胞AIF-1转录水平的表达(图7(a))。同时，蛋白免疫印迹结果也发现，灿烂弧菌的免疫刺激明显增加了呼吸树组织和体腔细胞AIF-1蛋白表达，与转录水平的结果一致(图7(b))。

(a) 荧光定量PCR

3 结 论

应用原核表达体系成功表达并纯化了带有His标签的刺参AIF-1重组蛋白，该蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达，可溶性重组蛋白具有很好的免疫原性，免疫小鼠后制备出了具有较高效价的鼠抗AIF-1抗血清，可以应用于蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光实验用于刺参AIF-1蛋白在蛋白样品中以及细胞原位表达的检测。应用制备的抗血清对刺参呼吸树组织和体腔细胞的AIF-1蛋白表达及灿烂弧菌体腔注射进行免疫刺激，对AIF-1表达的影响进行了分析，发现免疫刺激能够明显提高刺参呼吸树和体腔细胞AIF-1蛋白的表达。