仙乐雄胶囊对环磷酰胺诱导的小鼠生精功能损伤的保护作用

徐诗霞，李丽华，梁 亮，李 萍，张超凡，王 娟，沈可欣，喻丽珍,1b

(1.皖南医学院 a.药学院;b.现代中药研究所，安徽 芜湖 241002;2.芜湖绿叶制药有限公司 中药制剂研究中心，安徽 芜湖 241008)

据统计，全球约10%～15%的育龄夫妇存在不孕不育问题，即使现代诊断学技术日趋进步，其中仍有约40%～75%的男性患者存在不明原因的精液质量问题[1]。有文献报道，少弱精症的发生可能与机体内氧化应激损伤有关，正常男性体内存在动态平衡的氧化系统和抗氧化系统，生殖器官产生的各类活性氧(reactive oxygen species,ROS)可通过抗氧化系统的各类酶清除，使得睾丸、附睾尾等组织免于损伤[2]。近年来，国内外增强男性性功能的西药存在较多副作用，而中医药因具有药理作用缓和、毒副作用较小等特点逐渐受到认可[3]。仙乐雄胶囊是基于我国天然药物资源开发出的中药复方制剂，其君药淫羊藿苷成分可显著提高雄性动物的性器官指数和血清睾酮(Testosterone,T)水平，使去垂体大鼠仍表现出一定的类性激素样作用[4]，主要用于肾阳不足导致的勃起功能障碍的治疗。目前仙乐雄胶囊对男性少弱精症引起的不育研究较少，本研究主要探讨仙乐雄胶囊对少弱精症小鼠生精功能的作用，为扩大该药临床适应证提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级ICR小鼠，雄性，60只，体质量约16～18 g，购自山东省济南朋悦实验动物有限公司[许可证号SCXK(鲁)20190003]，自由给水和食物，12 h光照/12 h黑暗。

1.2 药物与试剂 仙乐雄胶囊(0.3 g/粒，批号180327)，芜湖绿叶制药有限公司提供。注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)(0.2 g/瓶，批号18111725)，购于江苏盛开迪医药有限公司；生精胶囊(每粒装0.4 g)，购于遵义廖元和堂药业有限公司；复方玄驹胶囊(每粒装0.42 g，批号20190207)，购于浙江施强制药有限公司；小鼠T ELISA试剂盒(批号CK-E30384)购于上海酶联生物科技有限公司；小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(货号A001-3)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)(货号A003-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-px)(货号A005)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)等试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。

1.3 动物模型的建立与分组 将购进的ICR小鼠随机分为6组，每组10只，依次为正常对照组、CP模型组、仙乐雄胶囊低剂量组(300 mg/kg)、高剂量组(600 mg/kg)、生精胶囊组(100 mg/kg)、复方玄驹胶囊组(500 mg/kg)，其中仙乐雄胶囊低剂量组、生精胶囊组、复方玄驹胶囊组均为临床等效剂量组[5]。除正常对照组给予同等剂量的溶媒外，其余各组给予相应药物灌胃30 d，自第25天开始模型组及各给药组以CP(60 mg/kg，腹腔注射)进行造模，持续5 d，正常对照组腹腔注射等剂量生理盐水。

1.4 观察指标 统计分析各组小鼠脏器指数(质量)、精子浓度、精子畸形率、单侧睾丸或附睾尾组织病理学特征、外周血清T水平、睾丸组织SOD、GR、GSH-px、MDA等的活性。

2 结果

2.1 仙乐雄胶囊对各组小鼠器官指数和质量的影响 CP模型组小鼠的睾丸指数、附睾尾质量均低于正常对照组(P<0.05)；与CP模型组相比，仙乐雄高剂量组、生精胶囊组和复方玄驹胶囊组睾丸指数、附睾尾质量均增加(P<0.05)，仙乐雄低剂量组小鼠附睾尾质量增加，但各组肾脏质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠器官指数或质量

2.2 仙乐雄胶囊对各组小鼠精子数量的影响 CP模型组小鼠附睾尾部精子浓度低于正常对照组(P<0.05)；与CP模型组相比，仙乐雄低剂量及高剂量组、生精胶囊组和复方玄驹胶囊组精子浓度均增加(P<0.05)，且高剂量组精子浓度增加优于复方玄驹胶囊组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠精子计数

2.3 仙乐雄胶囊对各组小鼠精子形态的影响 CP模型组小鼠畸形率高于正常对照组(P<0.05)，精子畸形主要表现为断头或断尾、香蕉型以及少见的双体等形态，见图1；与CP模型组相比，仙乐雄低剂量及高剂量组、生精胶囊组和复方玄驹胶囊组精子畸形率均降低(P<0.05)；且生精胶囊组精子畸形率低于仙乐雄高剂量组(P<0.05)。见表3。

A.正常小鼠精子；B～D.箭头所指为CP诱导下的畸形精子。

表3 各组小鼠精子畸形率

2.4 仙乐雄胶囊对各组小鼠睾丸和附睾尾组织病理学影响 HE染色结果显示，正常对照组小鼠睾丸组织生精小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整紧密，管内可见大量精子；附睾尾组织管腔亦可见大量精子，附睾管排列有序，未见明显异常(图2A、3A)。CP造模后，CP模型组小鼠睾丸组织曲细精管细胞层数减少，管腔内各级生精细胞排列紊乱，生精细胞出现较多脱落坏死；附睾尾组织出现大量浸润的炎症细胞和部分圆形细胞，精子数量及比例明显减少(图2B、3B)。给药后，仙乐雄低剂量组组织病理改变并不明显(图2C、3C)，仙乐雄高剂量组小鼠睾丸及附睾尾病理明显改善(图2D、3D)。生精胶囊组小鼠睾丸组织均较CP模型组有明显改善，但复方玄驹胶囊组小鼠的附睾尾组织仍可见少量浸润的炎性细胞和圆形细胞(图2E～F、3E～F)。

A.正常对照组；B.CP模型组；C.仙乐雄低剂量组；D.仙乐雄高剂量组；E.生精胶囊组；F.复方玄驹胶囊组。

A.正常对照组；B.CP模型组；C.仙乐雄低剂量组；D.仙乐雄高剂量组。

2.5 仙乐雄胶囊对各组小鼠外周血清T的影响 CP模型组小鼠外周血清T水平低于正常对照组(P<0.05)；与CP模型组相比，仙乐雄高剂量组、生精胶囊组以及复方玄驹胶囊组血清T水平均改善(P<0.05)，且高剂量仙乐雄组小鼠的外周血T水平高于低剂量组与生精胶囊组(P<0.05)，见表4。

表4 各组小鼠外周血清T表达水平

2.6 仙乐雄胶囊对各组小鼠睾丸组织氧化应激相关指标的影响 与正常对照组比较，CP模型组小鼠睾丸组织SOD、GR、GSH-px活力降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)；与CP模型组相比，仙乐雄高剂量组、生精胶囊组和复方玄驹胶囊组SOD、GR、GSH-px活力上调(P<0.05)，仙乐雄低剂量组SOD活力增强(P<0.05)，各用药组MDA下降(P<0.05)，详见表5。

3 讨论

近年来，“氧自由基”学说的研究倍受关注，由于ROS类物质可与细胞内DNA等作用发生氧化反应，损伤细胞结构。而精子内含细胞质成分较少，非饱和脂肪酸较多，因此抗氧化能力较差，易产生精子结构和功能的损伤[6]。有研究显示，CP可通过使机体内氧化系统与抗氧化系统失衡，造成睾丸组织内ROS代谢物积累，进而引起精子细胞膜脂质发生过氧化，DNA发生碎片化，引发男性少精弱精或精子畸形[7]。本研究发现经CP诱导后，ICR小鼠睾丸指数、附睾尾质量显著降低，精液浓度明显下降，畸形精子数量大大增加，睾丸组织曲细精管细胞层数减少，管腔内各级生精细胞排列紊乱且脱落坏死，附睾尾组织出现大量浸润的炎症细胞和部分圆形细胞，精子数量明显减少，血清T水平明显下降。

仙乐雄胶囊是由淫羊藿、人参、鹿茸、狗鞭、牛鞭、熟地黄构成的中药复方制剂，具有温肾补气、益精助阳的功效。仙乐雄胶囊联合强精冲剂治疗1个月后可将精液浓度和活力升高至近正常水平，3个月后外周血T和雌二醇水平接近正常值[8]。淫羊藿作为仙乐雄胶囊的君药，主要成分淫羊藿苷可显著提高皮质氧化应激快速老化小鼠的抗氧化能力[9]。许立等研究发现，仙乐雄胶囊中臣药人参可通过抑制氧自由基的产生而显著降低小鼠睾丸组织过氧化物的含量，进而产生抗氧化保护作用[10]。

本研究检测了睾丸组织抗氧化相关酶，结果显示，CP模型组小鼠SOD、NOS以及GSH-px显著降低，MDA显著增加。CP模型组小鼠睾丸组织MDA显著增加，SOD、GR以及GSH-px酶活力明显降低。仙乐雄显著改善了上述指标，推测可能通过改善SOD、GR以及GSH-px酶活性或含量，进而增加精子浓度，减少精子畸形率，改善睾丸、附睾尾病理评分等，提高生殖器官指数或质量。而仙乐雄胶囊对雄性小鼠外周血清T的影响可能是其淫羊藿苷成分通过调节下丘脑-性腺-睾丸轴体现该药的性激素样作用，这与文献报道基本一致[11-12]。

综上所述，仙乐雄胶囊可通过增强CP诱导的少精畸精症小鼠模型睾丸组织SOD、GR以及GSH-px等抗氧化酶活性，降低MDA水平，改善CP诱导的睾丸组织损伤，提高小鼠外周血T水平和器官指数或质量，具有重要的临床价值。