基于TGF-β1/Smads/ACTA2信号通路探讨猪食管ESD环切术后狭窄模型人工溃疡纤维化的机制

周鑫，马丹，付娟，王云锋，苏胜昌，唐祖鑫，李晓渝，陈洁,*，李志*

1西南医科大学中西医结合学院，四川泸州 646000；2西南医科大学附属中医医院脾胃病科，四川泸州 646000；3海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200082

内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)是治疗累及黏膜、黏膜下层的早期食管癌及癌前病变的主要措施之一，能有效地整块切除直径>2 cm的病灶[1]。人工溃疡部位狭窄是ESD术后最严重的并发症之一，当病变范围累及食管全周时，食管狭窄的发生率接近100%[2]，严重影响术后生活质量。有研究发现，食管ESD环切术后狭窄部位肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFB)标志蛋白——α肌动蛋白2(actin alpha 2，ACTA2)的表达明显上调，提示食管ESD环切术后狭窄可能与人工溃疡过度纤维化有关[3]。人体食管组织可取材部位有限，诱导食管过度纤维化的上游机制尚不明确，本研究建立猪食管ESD环切术后狭窄模型，以探讨人工溃疡过度纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8头普通级健康雄性实验白猪，体重(15.5±0.9) kg，购自上海市甲干生物科技有限公司[动物许可证号：SCXK(沪)2015-0005]。

1.2 试剂 注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮(舒泰®50，批号：6477)购自维克中国公司，硫酸阿托品注射液(批号：040191511)购自山西省芮城科龙兽药有限公司，PrimeScriptTMRT反应混合物(批号：RR036Q)、TB Green®Premix EX TapTMⅡ(批号：RR820A)购自日本TAKARA公司，BCA蛋白定量试剂盒(批号：ZJ102)购自上海雅酶生物医药科技有限公司，转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抗体(批号：NBP1-80289)购自美国NOVUS公司，共介导Smad蛋白2/共介导Smad蛋白3(Smad2/3)抗体(批号：#8685)购自美国CST公司，p-Smad2/3抗体(批号：D160746)购自美国Affinity公司，Smad4抗体(批号：D220124)、Smad7抗体(批号：D160746)购自上海生工生物工程股份有限公司，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗体(批号：23936-1-AP)、ACTA2抗体(批号：80008-1-RR)购自美国Proteintech公司，山羊抗兔IgG(批号：L3012)购自美国SAB公司。

1.3 仪器 TP1020石蜡组织包埋机、RM2235石蜡切片机购自德国LEICA公司；SpectraMax SM0260全自动酶标仪购自美国Molecular Devices公司；AXIO Scope A1光学显微镜购自德国ZEISS公司；Wonbio-48R高通量组织研磨仪购自上海Onebio Biotech公司，LightCycler 480实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.4 方法

1.4.1 实验分组与动物模型制备 将实验白猪适应性饲养1周后，随机均分为假手术组与模型组(n=4)。所有动物术前禁食24 h，禁水6 h。麻醉诱导前15 min肌内注射硫酸阿托品(0.05 mg/kg)抑制腺体分泌，随后肌内注射舒泰®50(10 mg/kg)诱导麻醉。麻醉后模型组给予气管插管，术中吸入1%～2%异氟烷维持麻醉深度，假手术组给予面罩吸氧。所有内镜操作过程中均使用心电图监测器观察白猪的生命体征。

实验白猪取左侧卧位，由经验丰富的消化内镜副主任医师用带有透明帽(ND-201-1802，Olympus公司)的上消化道内镜(GIF-Q260J，Olympus公司)进行操作，均已排除可能干扰本研究结果的食管病变。模型组采用“隧道法”，通过黏膜下注射分离黏膜层与固有肌层，在距离贲门10～14 cm处使用Dual刀(KD-650L，Olympus公司)进行人工溃疡颅侧及尾侧的圆周标记，先沿尾侧标记切开黏膜，再沿颅侧标记建立黏膜下隧道，然后逐渐与尾侧切口连接，联合使用Dual刀及IT-2刀(KD-611L，Olympus公司)完成黏膜下剥离。假手术组仅用带有透明帽的上消化道内镜轻触贲门上10～14 cm处的食管黏膜数次。实验过程符合国家和单位有关实验动物的管理和使用规定。

内镜操作结束后，将动物转移至安静温暖处，采用血氧饱和度监测仪观察生命体征直至麻醉苏醒。两组术后均禁食24 h，先给予流质饮食，再逐渐过渡至固体饮食，当模型组出现进食困难时，两组均切换为流质饮食。模型组造模后连续3 d肌内注射氨苄西林20 mg/(kg·d)抗炎，连续7 d喂服奥美拉唑10 mg/d抑酸。

1.4.2 标本采集 造模后间隔7 d行1次食管内镜检查，第3周模型组动物食管人工溃疡部位已明显狭窄且内镜不能通过，提示造模成功(图1)。处死动物后分别沿颅侧、尾侧横轴采集模型组食管人工溃疡部位组织，假手术组采集与模型组对应长度的食管组织。取部分组织全层于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋。剩余组织剔除固有肌层及外膜后，于-80 ℃保存。

图1 两组实验白猪造模后第3周内镜下食管形态Fig.1 Endoscopic esophageal morphology of each group of tested pigs at 3rd week after endoscopic mucosal dissection

1.4.3 HE染色 组织蜡块经切片、脱水、复水后，苏木精染色5 min，水洗，再于1%盐酸乙醇中分色5 s，自来水冲洗15 min，甩干，75%乙醇处理10 s后，直接置于1%醇溶性伊红染色1 min，水洗，无水乙醇脱水2 min，晾干，再以二甲苯透明10 min后，于通风处晾干，中性快干片封片。采用Image J图像处理软件对两组食管黏膜下层的成纤维细胞(fibroblasts，FB)与肌成纤维细胞(muscle fibroblasts，MFB)进行半定量分析(每张切片随机挑选5个视野)，以细胞总个数/细胞总面积为最终测定结果。

1.4.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相关基因mRNA的表达 称取100 mg食管组织，用高通量组织研磨仪研磨。采用Trizol法，依次加入Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书分别反转录为cDNA，反转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，保持4 ℃。参照Green®Premix EX TapTMⅡ试剂盒说明书进行qRT-PCR检测，扩增引物见表1。扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火，延伸30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.4.5 免疫组化检测CTGF、ACTA2的表达 组织蜡块经切片、脱水、复水、枸橼酸100 ℃水浴修复抗原、过氧化物酶阻断、封闭、CTGF及ACTA2一抗及相应种属的二抗孵育、显色、苏木精复染、盐酸乙醇分色、脱水、封片，在光镜下观察CTGF、ACTA2的表达情况。使用Image-Pro Plus图像处理软件对阳性结果行半定量分析(每张切片随机挑选5个视野)，结果采用平均光密度值表示(目的蛋白光密度值/图像面积)。

1.4.6 Western blotting检测TGF-β1/Smads/ACTA2信号通路相关蛋白的表达 取-80 ℃保存的100 mg食管组织，加入1 ml含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，采用组织研磨仪研磨后于冰上裂解30 min，涡旋振荡数次，15 000 r/min离心15 min；吸取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液，于100 ℃干热块上加热7 min使蛋白变性，微量离心2 min后于-80 ℃保存。蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至PVDF膜上，室温封闭2 h，TGF-β1(1:1000)、Smad2/3(1:1000)、p-Smad2/3(1:1000)、Smad4(1:500)、Smad7(1:1000)、CTGF(1:1000)、ACTA2(1:5000)

一抗按比例稀释后，置于摇床上4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育60 min，洗膜，显色，每组重复4次。采用凝胶图像分析成像系统进行条带检测，采用Image J图像处理软件对条带灰度值进行半定量分析，结果以目的蛋白与内参蛋白的相对表达量表示。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 食管组织HE染色 模型组食管人工溃疡部位复层鳞状上皮层变薄，再生上皮在人工溃疡部位不能连续分布；黏膜肌层缺失；黏膜下层新生的结缔组织增厚、致密，可见大量炎性细胞浸润。与假手术组比较，模型组FB/MFB大量增殖(14.992±0.291vs.28.510±0.612，P＜0.001)。FB形态呈多角形或扁平星形，细胞质染色较浅，细胞核大且呈规则卵圆形，核内可见细小黑色斑点，呈方向一致地束状排列。MFB呈长梭形，细胞核扁圆，与细胞外间质连接紧密，呈波浪形平行排列。假手术组食管组织黏膜层及黏膜下层完整，结缔组织疏松，内含少量排列杂乱的纤维细胞，除血管壁外几乎无MFB分布(图2)。

图2 两组实验白猪食管组织形态Fig.2 Morphology of esophageal tissues in each group of tested pigs

2.2 qRT-PCR检测食管组织TGF-β1、Smad2、Smad3、ACTA2mRNA的表达 与假手术组比较，模型组食管组织TGF-β1、Smad2、Smad3、ACTA2的mRNA表达均明显上调(P＜0.05，图3)。

图3 qRT-PCR检测两组食管组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、ACTA2 mRNA的表达Fig.3 Relative expression levels of TGF-β1, Smad2, Smad3,and ACTA2 mRNA in each group of esophageal tissues of tested pigs (qRT-PCR)

2.3 食管组织TGF-β1/Smads/ACTA2信号通路相关蛋白的表达

2.3.1 免疫组化检测CTGF、ACTA2表达 CTGF蛋白在模型组食管人工溃疡部位组织中的阳性表达升高，致密纤维组织中FB的细胞质可见黄色或棕褐色颗粒沉积；假手术组仅疏松结缔组织中纤维细胞的细胞质有少量CTGF蛋白表达。ACTA2蛋白在模型组增生纤维层MFB的细胞质中表达增强，部分细胞核可见表达，呈黄色或棕褐色平行的波浪形分布；而在假手术组的疏松结缔组织中仅血管壁肌细胞可见ACTA2阳性表达，在疏松结缔组织中的纤维细胞几乎不表达(图4)。对免疫组化染色结果进行半定量分析显示，模型组中CTGF、ACTA2的阳性表达水平均高于假手术组(P＜0.001，表2)。

图4 CTGF、ACTA2蛋白在实验白猪食管组织中的表达(免疫组化)Fig.4 The positive expression of CTGF and ACTA2 protein in esophageal tissue of tested pigs (Immunohistochemistry)

表2 实验白猪食管组织CTGF、ACTA2蛋白阳性表达半定量分析(平均光密度值，±s，n=4)Tab.2 Semi-quantitative analysis of positive expression of CTGF and ACTA2 protein in esophageal tissues of each group of tested pigs (average optical density value, ±s, n=4)

表2 实验白猪食管组织CTGF、ACTA2蛋白阳性表达半定量分析(平均光密度值，±s，n=4)Tab.2 Semi-quantitative analysis of positive expression of CTGF and ACTA2 protein in esophageal tissues of each group of tested pigs (average optical density value, ±s, n=4)

CTGF. 结缔组织生长因子；ACTA2. α-肌动蛋白-2

组别 CTGF ACTA2假手术组 0.017±0.003 0.021±0.002模型组 0.082±0.004 0.047±0.003 t 12.823 7.642 P＜0.001 ＜0.001

2.3.2 Western bloはing检测TGF-β1及其下游蛋白的表达 与假手术组比较，模型组TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4、Smad7、CTGF、ACTA2蛋白表达均明显上调(P＜0.05，图5)。

图5 实验白猪食管组织TGF-β1/Smads/ACTA2信号通路相关蛋白的表达(Western blotting)Fig.5 Expression of TGF-β1/Smads/ACTA2 related proteins in esophageal tissues of each group of tested pigs (Western blotting)

3 讨 论

我国是世界上食管癌发病人数最多的国家之一，2015年食管癌新发病例数为24.6万例，占全球发病人数的50%以上，并呈逐年上升趋势[4-6]。2012年、2017年日本食管协会发布的食管癌诊疗指南指出，食管切除范围不再是限制其内镜下治疗的禁忌证[7-8]，意味着ESD在食管癌诊疗中的应用将越来越广泛，但与此同时ESD相关并发症的发生率也将随之升高，食管狭窄就是其中之一。研究表明，食管ESD术后人工溃疡面积是狭窄发生的独立危险因素，且治疗范围越大，病变纵径越长，术后食管狭窄发生的风险就越高，当病变范围>3/4食管周径、病变纵径>5 cm时，极易出现顽固性食管狭窄，使患者术后生活质量严重降低[2,9]。因此，对食管ESD环切术后人工溃疡纤维化修复的机制研究变得尤为迫切。

本研究通过食管ESD环切术建立纵向约4 cm的人工溃疡，在术后第3周左右，模型组实验白猪半流质饮食进食困难，甚至有呕吐症状，电子胃镜检查提示人工溃疡部位出现明显狭窄，且直径为9.8 mm的内镜不能通过时，定义为造模成功，与Nonaka等[10]的研究结果基本吻合。从食管黏膜缺损愈合的时间进程来看，模型组白猪在食管ESD环切术后3周左右可形成明显狭窄。

TGF-β超家族在调节细胞生长、增殖、分化等方面有重要意义[11]，其中TGF-β1是一种来源广泛的关键致纤维化细胞因子，多种细胞(如FB、肝星状细胞、内皮细胞等)均可分泌TGF-β1[12]。当机体受到损伤时，多种细胞会分泌大量TGF-β1，通过调节Smad2/3蛋白磷酸化水平激活Smads信号通路，在共同介导蛋白Smad4的作用下，进一步与活化的转化生长因子-β1受体(transforming growth factor β receptor-Ⅰ，TβR-Ⅰ)结合，向细胞核传递相应的转录信号，激活转录因子，调节FB的增殖及分化，故TGF-β1又称为组织器官纤维化的“启动子”。Smad7是Smads信号转导通路的抑制性蛋白，通过竞争性地与活化的TβR-Ⅰ结合，使Smad2/3去磷酸化而失活，可以从侧面反映Smads通路的信号转导水平[13]。纤维化相关研究结果显示，TGF-β1拮抗剂可以抑制Smad2/3磷酸化，从而下调TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达，进而抑制FB的增殖[14]。Tang等[3]的研究表明，食管狭窄模型动物的血清TGF-β1水平明显升高，且与狭窄程度呈正相关。

本研究结果显示，无论在基因水平还是蛋白水平，模型组TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的表达均上调；Western blotting结果进一步提示，作为Smads信号转导的共介导蛋白之一，模型组Smad4的表达亦高于假手术组；抑制性蛋白Smad7的表达升高，可竞争性地与活化受体结合，促进Smad2/3的去磷酸化，从侧面反映出该通路的活化水平提高，这与现有的研究结果基本吻合[15]。因此，食管ESD环切术后人工溃疡部位管腔狭窄可能与组织损伤后多种细胞分泌TGF-β1增多及Smads信号通路过度活化有关。

CTGF是一类富含半胱氨酸的生长因子家族，具有明显的丝裂原性及趋化性，可调节多种类型细胞的黏附、迁移、增殖、存活及分化，在组织纤维化过程中发挥了重要作用[16]。Arias等[17]在纤维化体外实验中证实，CTGF启动子序列上存在TGF-β诱导CTGF所必需的功能性Smads结合位点，CTGF可能是TGF-β1/Smads信号转导通路的直接下游效应介质之一。Mori等[18]在小鼠皮肤纤维化模型中发现CTGF的持续表达是纤维化缓慢持续进展的重要环节之一。ACTA2是MFB的标志性蛋白之一，可以反映MFB的分化活性。有研究证实，CTGF与TGF-β1发挥协同作用，诱导肾小管上皮细胞发生表型转化，上调间质细胞中ACTA2的表达，促进肾脏间质中的FB转化为MFB[19]。Nonaka等[10]发现食管狭窄的特征性病理改变之一是大量MFB平行排列，水平延伸，从而促进凸起的管腔嵴形成。因此在纤维化病程中，CTGF是TGF-β1/Smads信号转导的关键下游效应靶点，可能与TGF-β1发挥协同作用，上调ACTA2的表达，促进纤维化持续进展，诱导FB向MFB表型转化。本研究结果显示，模型组ACTA2mRNA表达上调，CTGF、ACTA2蛋白表达明显高于假手术组，表明CTGF可能在TGF-β1/Smads转导通路的诱导下，上调功能性Smads位点结合水平，从而参与食管ESD环切术后人工溃疡部位过度纤维化的进程，促进FB增殖，并诱导其向MFB表型转化。但本研究对模型的观察周期仅为3周，尚不清楚相关蛋白在长期食管纤维化进展中的表达情况。

综上所述，本研究再次验证了猪食管ESD环切术后3周左右可形成食管狭窄；造模后人工溃疡部位多种细胞大量分泌TGF-β1，随后上调Smad2/3的磷酸化及核转位水平，促进Smads信号转导通路的进一步活化，以及下游转录介质CTGF的表达，从而上调细胞内ACTA2的表达，造成FB大量增殖并逐渐分化为MFB，并最终形成食管ESD环切术后狭窄。TGF-β1/Smads/ACTA2信号通路的过度活化可能是食管ESD环切术后人工溃疡过度纤维化修复的机制之一。