乳腺癌组织中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达与人乳头状瘤病毒16/18感染的关系及其临床病理意义

梅娟，马新义，张金莲，张正

乳腺癌是一种临床常见恶性肿瘤，其发病率逐年增加，但其病因尚未完全阐明。既往研究认为家族病史、生活方式等均为该病致病因素［1］。早期诊断乳腺癌对提高病人治疗及改善病人预后均有重要意义［2］。进一步探讨影响乳腺癌可能发生的内在机制及寻找分子标志物对提高临床早期诊疗效果具有重要应用价值。乳腺癌属血管依赖性病变，多种因素参与乳腺癌细胞转移及侵袭过程。基质金属蛋白酶（MMP）可降解细胞外基质及基膜进而促进肿瘤细胞发生迁移或侵袭。MMP-2、MMP-9 与肿瘤细胞浸润、迁移及侵袭的作用关系密切。MMP-9在乳腺癌组织中呈高表达，并可参与乳腺癌发生发展，可作为评估乳腺癌疾病进展的重要生物学标志物［3-4］。近年来研究显示，感染人乳头状瘤病毒（HPV）16/18 型可在E7 蛋白的黏膜和表皮胶质细胞中表达，并增强MMP 表达及活性，HPV16/18 型感染还与乳腺癌等其他脏器上皮肿瘤密切相关［5］。但是，乳腺癌病人中MMP-2、MMP-9 表达与HPV16/18感染的相关性研究相对较少。本研究拟通过检测乳腺癌病人癌组织中MMP-2、MMP-9 表达及HPV16/18 感染情况，初步分析MMP-2、MMP-9 表达与HPV16/18 感染的关系，为临床治疗及预防乳腺癌病人HPV16/18 感染提供理论依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性选取2015 年3 月至2018 年5月蚌埠医学院第二附属医院收治的90例乳腺癌病人为研究对象，乳腺癌病人行外科手术切除的标本为乳腺癌组，所有病人均经病理学检查确诊。收集90 例乳腺癌病人临床病理资料，包括肿瘤长径、淋巴结转移、组织学分级、临床分期、绝经状态、雌激素受体（ER）表达情况等。乳腺癌组病人年龄（52.16±5.24）岁，范围为45～70岁。同时选取同期该院85 例因良性疾病切除病变周围正常乳腺组织为对照组，病人年龄（51.57±4.65）岁，范围为43～72岁。两组年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：乳腺癌活组织检查前均未进行放疗或化疗；生存时间超过6 个月。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；患有自身免疫性疾病者；临床资料不全者。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

图1 基质金属蛋白酶（MMP）-2与MMP-9在乳腺正常组织和乳腺癌组织中的表达情况（免疫组织化学染色×400）

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9 mRNA 表达水平 取出冻存乳腺癌及正常乳腺组织样本，按照Trizol 试剂盒（日本TaKaRa 公司）说明书操作提取组织总RNA，逆转录为互补DNA（cDNA）。根据SYBR Green RCR master mix 试剂（北京优尼康生物科技有限公司）加样。反应体系（20 μL）：SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 样本2.0 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。荧光定量PCR 仪（西安天隆科技有限公司）程序：95 ℃1 min；95 ℃30 s、60 ℃30 s，40 个循环。MMP-2、MMP-9 均以β 肌动蛋白（β-actin）为内参基因。β-actin 5’-3’正向引物GTCGGTGAATGAAGTGCTTA，反向引物GCTTCGGGTAAGTTTGCCGG；MMP-2 5’-3’正向引物 ATTTTCCCCTCGACAGCCTC， 反 向 引 物GTCCCAGGCGTAGACCAATA；MMP-9 5’-3’正向引物AATATCAGACATTCGGGAGG，反向引物GTCAATGTACAGCTGCCCCA。采用2-ΔΔCt法计算MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量。

1.2.2 免疫组织化学法检测MMP-2、MMP-9 蛋白表达 乳腺癌及正常乳腺组织采用石蜡包埋制作石蜡切片（厚4 μm），脱蜡后置于甲醇溶液（含3%过氧化氢溶液）中，磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，放入乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液内（pH 8.00，95 ℃，10 min），室温冷却20 min，兔血清室温封闭切片，15 min 后去除多余液体，分别将一抗MMP-2（山羊抗人）、MMP-9（山羊抗人）均1∶200 分别滴加入切片，置于4 ℃冰箱内孵育过夜，次日用PBS 冲洗，滴加二抗（兔抗山羊），室温孵育20 min，PBS 冲洗，滴加DAB 进行显色反应，苏木精复染，梯度乙醇、二甲苯脱水透明，中性树脂封片，置于显微镜下观察。结果判定［6］：随机选取400倍镜下5个视野观察细胞染色强度及阳性细胞数目，（1）根据阳性细胞占观察细胞总数百分比分为＜5%（1 分）、5%～25%（2 分）、＞25%～50%（3 分）、＞50%～75%（4 分）、＞75%（5 分）；（2）根据阳性细胞染色程度积分为：淡棕黄色（1分）、棕黄色（2分）、棕褐色（3分）。由该院病理医师阅片并将两项积分乘积＞2分者判断为阳性表达，≤2分者判断为阴性表达。

1.2.3 HPV16/18 感染检测 采用原位杂交法对HPV16/18 DNA 检测，试剂盒购自福建迈新公司，操作步骤按照试剂盒说明书进行。取乳腺癌组织与正常乳腺组织标本，常规石蜡包埋、切片，并进行脱蜡水化、干燥处理，加入胃酶工作液37 ℃消化30 min，乙醇脱水、空气干燥。滴加25 μL HPV16/18 型DNA 探针，95 ℃原位杂交加热器上变性8 min，37 ℃湿盒孵育过夜，TBS 缓冲液清洗，每张切片中滴加50 μL 抗地高辛抗体，37 ℃湿盒孵育30 min 后加入二抗，DAB 显色，苏木精复染。同时采用已知的HPV16/18DNA 阳性切片为阳性对照，以TBS 液替代探针作阴性对照［7］。

1.3 统计学方法采用软件SPSS 22.0 分析。计量资料符合正态分布，以± s 表示，两组间比较采用两独立样本t 检验；计数资料用例（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平比较乳腺癌组病人MMP-2 mRNA（1.58±0.13）、MMP-9 mRNA（2.14±0.11）表达水平均显著高于对照 组（1.00±0.05、1.02±0.07）（t=38.53、79.83，均P＜0.001）。

2.2 免疫组织化学检测结果免疫组织化学结果显示MMP-2与MMP-9阳性信号位于细胞质中，染色呈浅黄色、棕黄色、棕褐色，见图1。乳腺癌组MMP-2 与MMP-9 蛋白阳性表达率显著高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 免疫组织化学染色检测两组基质金属蛋白酶（MMP）-2与MMP-9蛋白表达结果/例（%）

2.3 HPV16/18-DNA 检测结果乳腺癌组HPV16/18-DNA 阳性率71.11%（64/90）显著高于对照组12.94%（11/85）（χ2=60.40，P＜0.001）。

2.4 HPV16/18 感染、MMP-2、MMP-9 表达与乳腺癌病人临床病理特征的关系观察MMP-2、MMP-9表达及HPV16/18 感染与否与乳腺癌病人临床病理特征的关系，结果显示MMP-2、MMP-9 表达及HPV16/18 感染与否均与淋巴结转移、临床分期、绝经状态、ER 阳性明显相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.5 乳腺癌MMP-2、MMP-9 表达与HPV16/18 感染的关系62 例MMP-2 阳性表达病人同时HPV16/18-DNA 呈 阳 性，61 例MMP-9 阳 性 表 达 病 人 同 时HPV16/18-DNA 呈 阳 性，MMP-2、MMP-9 表 达 与HPV16/18 感染存在明显相关性（P＜0.05），差异有统计学意义见表3。

3 讨论

癌细胞增殖、迁移及侵袭是导致乳腺癌病人死亡的重要原因。研究显示，肿瘤细胞移向血管壁并附着于血管壁或贴壁血栓，进而促使肿瘤细胞增殖及浸润［8］。

HPV是一组双链DNA病毒，乳腺癌组织中HPV高表达，HPV 可参与乳腺癌发生过程［9］。HPV E6和E7癌蛋白具有锌指结构域，二者在转化细胞中持续表达，对细胞转化和维持转化组织恶性表达起重要作用。有研究显示，HPV 致癌机制一般认为与HPV DNA 整合有关，HPV E6 蛋白可通过E6 相关蛋白与P53 结合，达到抑制P53 蛋白与DNA 特异性位点结合，同时，也可导致已结合的P53 蛋白从DNA 上解除，并促使P53蛋白经过泛素介导途径而降解，最终造成细胞增殖失控及细胞凋亡机制缺陷，导致细胞永生化现象［10］。本研究结果显示，乳腺癌组HPV16/18-DNA 阳性率显著高于对照组，提示HPV16/18-DNA 阳性组乳腺癌发生率升高，乳腺癌发生可能与HPV感染相关。

表3 乳腺癌90例MMP-2、MMP-9表达与HPV16/18感染的关系/例

表2 HPV16/18感染、MMP-2、MMP-9表达与乳腺癌90例临床病理特征的关系/例（%）

MMP-2 是一种Ⅳ型胶原酶并可降解基底膜骨架成分，进而参与肿瘤细胞转移及侵袭过程。研究显示乳腺癌肿瘤细胞中MMP-2 呈高表达并与淋巴结转移及TNM 分期密切相关［11］。MMP-9 是促进细胞基底膜及细胞外基质降解的主要酶，可参与乳腺癌发生及发展过程，并可作为判断乳腺癌浸润及转移的重要生物学指标；同时，MMP-9 还可通过上调血管生成因子表达水平，进而诱导血管生成，从而促进肿瘤细胞增殖及迁移［12］。研究表明，Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌病人中MMP-2、MMP-9 呈高表达，并与血管内皮生长因子D 呈明显正相关，临床上可通过抑制MMP-2、MMP-9 表达进而治疗乳腺癌，即MMP-2 与MMP-9 可能作为临床治疗乳腺癌的靶标基因［13］。MMP-2、MMP-9 表达水平与乳腺癌病人淋巴结转移有关，并可通过促进淋巴管生成进而促进淋巴结转移［14］。与上述报道相似，本研究结果显示，乳腺癌组MMP-2、MMP-9 mRNA 表达水平显著高于对照组，免疫组织化学显示乳腺癌组MMP-2与MMP-9蛋白阳性表达率显著高于正常组，提示MMP-2、MMP-9 可能与乳腺癌发生发展关系密切。另外本研究结果还显示，MMP-2、MMP-9 表达均与淋巴结转移、临床分期、绝经状态、ER阳性明显相关，随着病人淋巴结发生转移及临床分期的增加，MMP-2、MMP-9 阳性表达均明显高于阴性表达，提示MMP-2、MMP-9高表达可能参与乳腺癌发展过程。

有报道显示，子宫颈癌组织中HPV 感染与MMP-7、MMP-9 表达密切相关，并与病人淋巴结转移等临床病理参数相关［15］。另外，郭真真等［16］研究显示，MCF-7-E6 细胞和MCF-7-E7 细胞中MMP-9 蛋白表达水平明显高于MCF-7 亲本细胞与MCF-7-Vect 细胞，认为MMP-9 是降解Ⅳ型胶原三螺旋结构的主要酶系。在乳腺癌中，HPV16 E6 和E7 可能通过促进MMP-9 的表达参与肿瘤的侵袭和转移。本研究比较乳腺癌MMP-2、MMP-9 表达与HPV16/18感染的关系，结果显示MMP-2、MMP-9与HPV16/18-DNA 呈显著相关性，说明MMP-2、MMP-9 表达与HPV16/18 感染存在明显相关性。提示MMP-2、MMP-9 表达及HPV16/18 阳性可增加乳腺癌发生发展概率。关于MMP-2、MMP-9 与HPV16/18 阳性的内在分子关系目前尚不完全明确，有待进一步深入研究。

本研究表明，乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9 呈高表达，其表达与HPV16/18正相关，推测HPV16/18影响癌组织中MMP-2、MMP-9 表达水平，促进乳腺癌的发生发展，加重疾病进程。但本研究尚未排除乳腺癌病人机会性感染HPV16/18 情况，还需进一步扩大样本量继续研究HPV16/18 感染、MMP-2、MMP-9 表达与乳腺癌的关系，以期揭示病毒对肿瘤发生及发展的影响。

（本文图1见插图9-3）