蒋学军,杨勇,庹磊,吉祖进,雷新益
中药在癌症的治疗中越来越多地发挥作用,研究表明,中药联合化疗在结直肠癌的治疗中发挥良好的效果,中药可提高病人免疫力,抑制癌细胞的增殖,对延长病人生存期、提高病人生存质量起一定的作用[1-2]。
艾叶为菊科蒿属植物艾的叶子[3]。研究发现,艾叶提取物对肝癌、胃癌、宫颈癌具有一定的抑制作用,且其呈明显的剂量依赖[4-5],但艾叶提取物对结直肠癌的影响及其机制目前还不清楚。研究表明,微小RNA(miR)-26b 在人结直肠癌组织和耐药细胞株HT-29/5-氟尿嘧啶(5-FU)和LOVO/5-FU 细胞中表达水平下调,且miR-26b 在体外可提高结直肠癌细胞对5-FU 的敏感性,在体内增强了5-FU 对肿瘤生长的抑制作用[6]。而本研究通过预测发现,LINC01606 与miR-26b 之间存在结合位点。LINC01606在胃癌中高表达,与胃癌细胞迁移、侵袭有关[7],在结直肠癌中的表达和转移尚不清楚。基于以上研究和预测结果,本研究于2018 年6 月至2019 年11 月以人结直肠癌细胞系SW1116 为研究对象,假设艾叶乙酸乙酯提取物通过调控LINC01606/miR-26b 途径影响结直肠癌细胞的增殖和凋亡,并对其进行验证。
1.1 材料人结直肠癌细胞系SW1116购自美国模式菌种收集中心(ATCC);艾叶药材来自湖北医药学院附属国药东风总医院中药房,经中药师鉴定为菊科植物艾的干燥叶;胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich 公司;Transwell 板购自美国Corning 公司;Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂Trizol、Realtime PCR 试剂盒、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自美国Invitrogen 公司;DMEM 高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco 公司;流式法细胞凋亡检测试剂盒和人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(CCK-8)检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;LINC01606 过表达载体(pcDNA3.1-LINC01606)、LINC01606 抑制物(si-LINC01606)、miR-26b 模拟物(miR-26b)、miR-26b 抑制物(antimiR-26b)、空载体(pcDNA3.1)及阴性对照(miR-NC、anti-miR-NC、si-NC)购自苏州吉玛基因;周期素依赖激酶抑制剂p21(P21)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自英国Abcam;流式细胞仪购自美国BD 公司;Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和药物处理 细胞培养:在含1%青-链霉素、10%FBS 的DMEM 高糖培养基中培养SW1116 细胞,置于5%二氧化碳、37 ℃培养箱中培养至对数生长期,胰蛋白酶消化传代。药物处理:艾叶乙酸乙酯提取物采用文献[8]方法提取和制备。细胞过夜培养至贴壁状态时弃去培养液,加入含艾叶乙酸乙酯提取物12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L浓度的DMEM 高糖培养液,分别称为实验1、2、3组,培养48 h,根据结果选择最佳处理浓度。
1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测LINC01606 和miR-26b 的表达 收集实验1、2、3 组的SW1116 细胞,Trizol 试剂提取细胞总RNA,逆转录合成互补DNA(cDNA),按Real-time PCR 说 明 书 合 成LINC01606 和miR-26b,95 ℃1 min;94 ℃30 s、59 ℃40 s、72 ℃42 s,35 个循环;72 ℃5 min。LINC01606 正向引 物:5'-GCTGGACATTTCTCCTTCA-3',反向引物:5'-GAGTCCTCTCGCTTCCTCCT-3';GAPDH 正向引物:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',反向引物:5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3';miR-26b 正 向 引 物:5'-CCCAAGCTTAAAAACCTCCACCACGAAT-3',反 向引物:5'-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATTCAGG-3';U6 正向引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3',反向引物:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3';运用2-ΔΔCt法进行数据分析。
1.2.3 细胞转染 取对数生长期的SW1116 细胞用培养液稀释为1×l06~2×l06个细胞/毫升,接种于6 孔板(每孔200 μL 细胞)中培养。细胞融合度达到80%时,按照转染试剂说明书操作。将转染分组:LINC01606 过表达组(转染pcDNA3.1 和pcDNA3.1-LINC01606),LINC01606 抑制+药物组(转染si-NC和si-LINC01606,然后用10 mg/L 艾叶乙酸乙酯提取物处理48 h)。转染48 h,收集细胞。
1.2.4 CCK-8 实验检测细胞增殖 将SW1116 细胞以5×103个/孔(100 μL)接种于96 微孔板中,培养24 h 至贴壁后,换培养液,加入含艾叶乙酸乙酯提取物12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 浓度的DMEM 高糖培养液继续培养48 h,每孔加入100 μL CCK-8 溶液,培养2 h,酶标仪测定450 nm 吸光度,细胞存活率%=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。
1.2.5 流式细胞术测定细胞凋亡率 收集各组SW1116 细胞并稀释,以5×104个/孔接种于6 孔板中,过夜贴壁后换为含艾叶乙酸乙酯提取物12.5、25、50 mg/L 浓度的DMEM 高糖培养液继续培养48 h,收集细胞用胰蛋白酶消化后依据凋亡试剂盒说明书操作。加入5 μL 标记的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和5 μL 碘化丙啶(PI)混匀,室温避光孵育20 min,加入缓冲液,流式细胞仪检测凋亡率。
1.2.6 蛋白质印迹法 用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解各组SW1116 细胞并超声破碎,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,封闭1 h。加入稀释的一抗(P21抗体1∶2 000、caspase-3 抗体1∶2 000 和GAPDH 抗体1∶4 000),4 ℃孵育过夜。等渗缓冲盐溶液(TBST)洗膜3 次,然后加入稀释的酶标二抗,室温孵育2 h。以GAPDH为内参照,分析蛋白水平。
1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 按照“1.2.3”的方法要求培养SW1116 细胞,将构建的lncRNA LINC01606 野 生 型(WT-LINC01606)和 突 变 型(MUT-LINC01606)双荧光素酶报告载体,分别与miR-NC 或miR-26b 共转染SW1116 细胞,转染48 h后裂解细胞。以海肾荧光素酶活性为内参照,检测并计算裂解后的上清中相对萤火虫荧光素酶活性。
1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计,结果均以± s表示。采用两独立样本t检验比较两组间数据差异,采用单因素方差分析比较多组间数据差异,采用SNK-q检验进行多组间的两两比较,P<0.05代表差异有统计学意义。
2.1 艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌细胞SW1116增殖和凋亡的影响与对照组相比,实验1、2、3 组的SW1116细胞克隆形成数、存活率和S期细胞百分比逐渐降低(P<0.05),P21、caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率及G1 期细胞百分比均逐渐升高(P<0.05),呈显著剂量依赖趋势,剂量越高效果越显著,见表1。说明艾叶乙酸乙酯提取物可抑制SW1116细胞增殖,促进细胞凋亡。
2.2 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116 中LINC01606、miR-26b表达的影响与对照组相比,实验1、2、3 组的SW1116 细胞中LINC01606 含量逐渐降低(P<0.05),miR-26b 逐渐升高(P<0.05),呈显著剂量依赖趋势,剂量越高效果越显著,见表2。选用实验3组抑制率约为50%的艾叶乙酸乙酯提取物浓度(50 mg/L)进行后续实验。
表2 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116中LINC01606、miR-26b表达的影响/± s
表2 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116中LINC01606、miR-26b表达的影响/± s
注:①与对照组比较,P<0.05。
组别对照组实验1组实验2组实验3组F值P值重复次数3333 LINC01606 1.01±0.06 0.76±0.05①0.51±0.05①0.34±0.04①100.90<0.001 miR-26b 0.98±0.08 1.26±0.09①1.41±0.10①1.69±0.12①27.08<0.001
2.3 过表达LINC01606 能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116 增殖、凋亡的影响转染pcDNALINC01606 以实现过表达LINC01606,与对照实验3组+pcDNA3.1组相比,实验3组+pcDNA3.1-LINC01606组SW1116 细胞中LINC01606 含量显著升高,细胞克隆形成数、存活率和S 期细胞百分比均升高(P<0.05),P21、caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率及G1期细胞百分比均降低(P<0.05)。见图1,表3。说明过表达LINC01606 可逆转艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116细胞增殖和凋亡的影响。
2.4 抑制miR-26b 能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116 增殖、凋亡的影响与对照实验3 组+pcDNA3.1 组相比,实验3 组+pcDNA3.1-LINC01606组SW1116 细胞中miR-26b 含量显著降低P<0.05),细胞克隆形成数、存活率和S 期细胞百分比均升高(P<0.05),P21、caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率及G1 期细胞百分比均降低(P<0.05),见图2,表4。说明抑制miR-26b 可逆转艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116细胞增殖和凋亡的影响。
表1 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡及细胞周期的影响/± s
表1 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡及细胞周期的影响/± s
注:P21为周期素依赖激酶抑制剂p21,caspase-3为胱天蛋白酶-3。①与对照组比较,P<0.05。
组别对照组实验1组实验2组实验3组F值P值重复次数3333 P21 0.22±0.03 0.34±0.03①0.47±0.04①0.67±0.05①75.46<0.001 caspase-3 0.14±0.02 0.26±0.02①0.38±0.03①0.59±0.04①133.91<0.001克隆形成数120±10 101±9①79±8①56±6①32.15<0.001存活率/%100.01±9.68 81.57±8.02①68.17±6.69①48.26±4.91①25.20<0.001凋亡率/%8.19±0.93 13.37±1.21①17.94±1.47①24.36±1.69①77.08<0.001 G1/%28.69±2.33 32.17±2.41①37.04±2.75①41.20±3.24①36.96<0.001 S/%35.18±2.56 31.98±2.39①26.10±2.21①23.21±2.04①50.09<0.001 M/%36.13±2.74 35.85±2.62 36.86±2.59 35.59±2.63 0.39 0.764
图1 过表达LINC01606能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞P21、caspase-3蛋白表达的影响
图2 抑制miR-26b能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞P21、caspase-3蛋白表达的影响
2.5 LINC01606 靶 向 调 控miR-26bTargetScan 预测发现miR-26b 序列中含有与LINC01606 互补的位点,见图3。双荧光素酶报告实验表明,与miR-NC组相比,miR-26b组的WT-LINC01606报告载体的荧光素酶活性(0.92±0.05 比0.29±0.03)显著降低(t=18.71,P<0.001),MUT-LINC01606 报告载体的荧光素酶活性(0.95±0.06 比0.94±0.06)差异无统计学意义(t=0.20,P=0.848),说明两者存在靶向结合关系。qRT-PCR 结 果 发 现,pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-LINC01606 组、si-NC 组、si-LINC01606 组miR-26b 表达 水 平 分 别 为0.99±0.06、0.35±0.04、0.98±0.06、1.49±0.09,四组整体比较差异有统计学意义(F=154.81,P<0.001);过表达LINC01606 可下调miR-26b 的含量(P<0.05),抑制LINC01606 可上调miR-26b 的含量(P<0.05)。说明LINC01606 靶向调控miR-26b。
图3 TargetScan预测发现LINC01606靶向miR-26b
越来越多的研究表明,中医药联合化疗和放疗等方式可有效改善肿瘤病人预后[9]。艾叶是菊科蒿属植物艾的干燥叶子,在我国各地生长广泛,具有祛寒止痛、温经止血的作用,它的提取物包括挥发油类、黄酮类、三萜类、桉叶烷类等,具有抗氧化、抗菌抗病毒、抗肿瘤、肝胆保护和提高免疫力等功能[10]。蕲艾鞣酸可抑制肝癌细胞HepG2 细胞增殖并促进细胞凋亡[11]。艾叶乙酸乙酯提取物对乙肝病毒HBV 有限制的抑制作用[8]。本研究提取艾叶乙酸乙酯提取物并处理结直肠癌细胞,发现12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 艾叶乙酸乙酯提取物可抑制结直肠癌细胞SW1116 的克隆形成数,降低细胞存活率,提高细胞凋亡率和细胞中P21、caspase-3 蛋白含量,抑制细胞增殖并促进细胞凋亡,50 mg/L 的艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116 细胞的抑制率约为50%,验证了艾叶乙酸乙酯提取物的抗肿瘤作用,但其具体机制尚不清楚。
表3 过表达LINC01606能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s
表3 过表达LINC01606能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s
注:P21为周期素依赖激酶抑制剂p21,caspase-3为胱天蛋白酶-3。
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表4 抑制miR-26b能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s
表4 抑制miR-26b能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s
注:P21为周期素依赖激酶抑制剂p21,caspase-3为胱天蛋白酶-3。
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有研究表明,miR-26b 在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织,miR-26b 的过表达可靶向抑制Zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)表达,抑制癌细胞增殖、侵袭及迁移[12]。研究也发现,miR-26b在结直肠癌三个细胞系中表达显著降低,可通调控核因子E2 相关因子3(NFE2L3)促进结直肠癌恶性进展[13],且miR-26b 在体内可增强5-FU 对肿瘤生长的抑制作用[6]。miR-26b 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等中低表达,miR-26b 发挥肿瘤抑制因子的作用,其过表达可抑制肿瘤细胞增殖,并可抑制胃癌的紫杉醇的化疗耐药性[14-18]。本研究通过TargetScan 预测发现,miR-26b 可能是LINC01606 的靶点。LINC01606在胃癌中表达水平升高,并通过Wnt/β-连环蛋白信号通路调控癌细胞的转移和侵袭[19]。基于以上结果,本研究假设艾叶乙酸乙酯提取物可能通过调控LINC01606/miR-26b 途径抑制结直肠癌细胞的增殖,并促进细胞凋亡。本研究经检测发现,艾叶乙酸乙酯提取物可提高SW1116 细胞中miR-26b 的水平并降低LINC01606 的水平,呈显著剂量依赖性。本研究结果表明,过表达LINC01606 和抑制miR-26b 均可逆转艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116 细胞增殖和凋亡的影响;而双荧光素酶报告系统结果表明,LINC01606 靶向负调控miR-26b。
综上所述,50 mg/L的艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌SW1116 细胞的抑制率约为50%,艾叶乙酸乙酯提取物可能通过调控LINC01606/miR-26b 抑制SW1116 细胞增殖,促进细胞凋亡。艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌具有潜在的抑制作用。本研究只进行了一种结直肠癌细胞的体外实验,下一步将进行动物模型体内实验,进一步为艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌的抑制作用提供数据支撑。