绵马贯众及其伪品的红外指纹图谱鉴别

程友斌，王政，褚朝森，孙静

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨带叶柄残基的干燥根茎，始载于《神农本草经》，列为下品，其味苦，性微寒，有小毒，具有清热解毒和驱虫等功效［1］，主产于黑龙江、吉林等地，临床用于治疗疫毒感冒，虫积腹痛等疾患，现代药理研究表明其有抗病毒、抗肿瘤和抗菌等作用，在国家《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中有推荐使用。近几版《中国药典》均将绵马贯众予以单列，然而因绵马贯众药源植物历史构成较为混乱，曾用作贯众的原植物有11科18属58 种之多［2］，经过长期考证和市场规范，目前市场上仍有约5种以上植物的根茎被混充作绵马贯众使用，他们在外观形态特征上与绵马贯众十分相似，非鉴别经验丰富者不能准确感官鉴定，常规理化鉴别如紫外可见光谱法（UV）、聚合酶链式反应（PCR）、高效液相色谱法（HPLC）等质量控制方法［3-4］均存在样品处理程序复杂、耗时费力、难以完全满足生产一线对其快速鉴别的需要，而红外光谱法可从整体上把握中药体系成分，具有取样量小、快速、准确，以及专属性和特征性强等特点［5-9］，可较好填补绵马贯众的这一实际需求，目前国内关于绵马贯众的研究［10-11］中尚未见到应用红外光谱法鉴别绵马贯众正伪药材的报道，亦鲜见使用红外光谱对5 种伪品药材整体进行鉴定的报道。本实验于2019 年10 月至2020 年11 月以9 个产地绵马贯众与5 种伪品为研究对象，建立绵马贯众的红外指纹图谱，并结合二阶导数、相似度评价，聚类分析和主成分分析（PCA），为绵马贯众的鉴别和质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材药材购于吉林敦化、和龙、蛟河、龙井、汪清、通化、延吉，黑龙江牡丹江和尚志，以及安徽亳州、河北安国、广西玉林等地，经湖北中医药大学药学院生药鉴定教研室潘宏林教授鉴定为绵马贯众、峨嵋蕨贯众、鳞毛蕨贯众、单芽狗脊蕨贯众、狗脊蕨贯众和苏铁蕨贯众。凭证标本存于江苏省连云港中医药高等职业技术学校中医药博物馆，基源鉴定结果见表1。

1.2 仪器与试剂傅里叶变换红外光谱仪（日本SHIMADZU 公司，型号IRPrestige-21），DLATGS检测器、XS105DU 十万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO 公司），HY-12 粉末压片机（天津天光光学仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A上海精宏实验设备有限公司），玛瑙研钵（阜新县伟成玛瑙厂）；溴化钾（光谱纯，天津市福晨化学试剂厂）。

1.3 方法

1.3.1 供试品的制备 取9份不同产地绵马贯众样品，以及峨眉蕨贯众、鳞毛蕨贯众、单芽狗脊蕨贯众、狗脊蕨贯众和苏铁蕨贯众等5 种伪品各一份于60 ℃干燥4 h，粉碎后过200 目筛，得到饮片粉末备用。取样品粉末2 mg 至玛瑙研钵中，加入120 ℃干燥后溴化钾粉末作为分散剂，样品与溴化钾混合比例为1∶200，研磨均匀，取适量研磨后的粉末平铺于红外压片磨具中，以25 MPa 压力压制60 s，取出，对光检视，以样片均匀，半透明为合格，作为供试品［12］。

1.3.2 红外光谱分析条件 将制备好的供试品压片置于红外光谱仪中测定，测定波数段为4 000～400 cm-1，扫描信号累加20 次，分辨率为4 cm-1，室内温度与湿度分别控制在24 ℃和25%～35%，扫描室实时扣除水和二氧化碳的干扰。扫描完成后，使用OMNIC8.2扣除背景，并进行基线校正和自动平滑处理，计算各样品的二阶导数红外光谱平滑点数为17点。

1.3.3 方法学考察

1.3.3.1 精密度实验 从14 份供试品中随机取一份按“1.3.1”项下制备方法压片，测定，连续扫描6次，以所得红外光谱数据相似度为评价指标，评价仪器的精密度。结果6 次所测光谱相似度均在0.99以上，显示红外光谱仪精密度状态良好。

1.3.3.2 重现性实验 从14 份供试品中随机取一份按“1.3.1”项下制备方法，平行压片6 份，分别测定，以所得红外光谱数据相似度为评价指标，评价实验方法重现性。结果6份样品光谱数据相似度均在0.98以上，表明本实验方法重现性良好。

1.3.3.3 稳定性实验 从14 份供试品中随机取一份按“1.3.1”项下制备方法压片，供试品置于干燥器中，分别在0、1、2、3、4、5 h 时各测试1 次，汇总光谱图，并以所得红外光谱数据相似度为评价指标，评价实验方法稳定性。结果6个时段测定的光谱数据相似度均在0.98 以上，反映供试品在6 h 内稳定性良好。

2 结果

2.1 共有峰确定与伪品原始光谱之间的比较分析将14 份供试品按照“1.3.1”项下制备方法分别压片、测定，得到9 个产地绵马贯众光谱结果，通过对该9 批红外光谱的分析和比较，确定了16 个共有峰，分别是530、577、610、705、766 、859、1 018、1 154、1 201、1 257、1 284、1 372、1 444、1 627、2 925、3 357 cm-1，数据见表2。

表1 9个产地绵马贯众（S1～S9）及5种伪品（W1～W5）来源及鉴定信息

将9批绵马贯众红外光谱进行平均计算后作为共有模式，再与5种伪品原始光谱进行比较分析，结果显示5 个伪品均存在一个吸收尖峰，而1 554～1 494 cm-1波段之间，共有模式为一个中等吸收肩峰，此外1 304～1 165 cm-1波段共有模式吸收强度小于伪品，其余波段吸收则均强于所有伪品。为进一步探索各样品吸收峰之间的差别，本实验又进行了二阶导数分析。

2.2 二阶导数光谱之间的比较分析绵马贯众共有模式与5种伪品二阶导数图谱比对见图1，分析结果表明共有图谱与5 种伪品在3 个不同波段上的吸收峰数目和强度均有不同，其中共有图谱在4 000～3 500 cm-1波段为中等吸收，在1 748～1 604 cm-1波段吸收峰数目为4 个，5 种伪品与此不同。同时，对照原始光谱图形，对1 554～1 494 cm-1波段之间光谱观察，共有模式与5 个伪品在此区间均为峰谷。见表3。

表2 9个产地绵马贯众（S1～S9）及5种伪品（W1～W5）红外图谱相似度分析结果

图1 绵马贯众共有模式与5种伪品（W1～W5）红外二阶导数光谱

表3 绵马贯众与5种伪品（W1～W5）的二阶导数图谱特征

2.3 相似度评价通过OMNIC 8.2 对所有供试品红外光谱进行标峰，得到各吸收峰的波数与吸光度数值，以9 个产地绵马贯众供试品红外光谱中共有峰吸光度的均值为参照，以夹角余弦和相关系数评价相似度，分别计算不同产地绵马贯众及5 种伪品的相似度。由表2可知，9个产地绵马贯众之间相似度很高，相关系数均在0.96以上，夹角余弦也在0.98以上，说明不同产地绵马贯众饮片质量基本稳定，具有很好的一致性。同时与峨嵋蕨贯众、鳞毛蕨贯众、单芽狗脊蕨贯众、狗脊蕨贯众和苏铁蕨贯众之间表现出较低的相似性，其中相关系数较高的是狗脊蕨贯众（0.801），狗脊蕨贯众（0.728），夹角余弦计算结果同样反映绵马贯众与狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众较为接近，分别为0.918 和0.905，同时5 种伪品之间相似度也存在差距，以苏铁蕨贯众差别最大，此结果与正伪品性状鉴定结果一致。

2.4 绵马贯众与各伪品之间的聚类分析根据表2红外光谱分析结果，以各峰位的吸光度为变量，采用组间连接方法，选取欧氏平方距离作为区间测度，通过SPSS 22.0作为统计分析软件进行分层聚类分析。结果可知在欧氏距离平方和为5 时，可以分成5 大类，其中9 个产地绵马贯众归为一类（S1～S9），单芽狗脊蕨贯众与狗脊蕨贯众归为一类（W3，W4），显示二者亲缘关系较近，而苏铁蕨贯众（W5）、鳞毛蕨贯众（W2）和峨嵋蕨贯众（W1）则独立分开，分析结果与相似度分析相一致。见图2。

2.5 绵马贯众与各伪品之间的PCAPCA 是将多个变量通过线性变换以选出较少重量变量的一种多元统计分析方法，运用PCA 方法可以在不降低光谱差异的前提下，减少数据维数，将每条光谱与其他光谱进行比较［13-14］。将全部14批样品红外图谱所有吸收峰吸光度值作为变量（见表2），通过SPSS 22.0 进行PCA，结果见图3。图3 为14 批样品的三维散点图，所提取的3 个成分对分析结果的贡献率分别是75.7%、14.4%和6.3%，累计贡献率达到了96.4%，包含了原数据中大部分信息，可知分析结果反映了样品的真实情况。图3 表明除了S1 和S8 产地为吉林敦化和通化的两个样品点稍有离散，其余绵马贯众样品点基本重合（S2～S7），但仍然都较好地归集到了一个区域，而W1～W5 全部伪品样品点则完全离散，其中单芽狗脊蕨贯众（W3）和狗脊蕨贯众（W4）与绵马贯众距离相对较近，此结果与相似度分析和聚类分析保持一致。

3 讨论

图2 9个产地绵马贯众（S1～S9）及5种伪品（W1～W5）红外光谱聚类分析谱系图

图3 9个产地绵马贯众（S1～S9）及5种伪品（W1～W5）红外主成分分析图

本实验选取9 个产地绵马贯众和5 种常见伪品作为研究对象，建立了绵马贯众红外光谱共有模式，利用原始红外光谱和二阶导数光谱进行图形特征识别分析，利用相似度、聚类分析和PCA 的化学计量法进行了数据分析。结果表明9个产地绵马贯众红外光谱相似度较高，相似度均在0.960 以上，红外光谱吸收曲线亦大致重叠，但部分波段吸光度有高低之分，显示各地样品的成分含量存在差异，此结果可能与样品生长地理环境之间存在关联。共有光谱与5个伪品的比较结果显示相似度最高的是W4狗脊蕨贯众，其夹角余弦达到0.918，相关系数在0.801，其余依次走低，此趋势与市场实际鉴别差错率情况相符。共有峰与伪品图谱进一步对比发现波段之间，5 个伪品均存在一个吸收尖峰，而共有模式为一个中等吸收肩峰。真伪样品的二阶导数光谱在1 554～1 494 cm-1区域虽然均为峰谷，但是谷形略有差别，此与原始光谱中的吸收峰和肩峰在二阶导数中均显示为峰谷特性有关，而二阶导数在4 000～3 500 cm-1、1 748～1 604 cm-1和1 110～990 cm-1三个区域中吸收峰数目明显不同，可资区别。进一步采用聚类分析方法分析结果表明在平方欧氏距离为5时，即可将9个产地绵马贯众与5种伪品归为4类，正品绵马贯众1类，5个伪品归为3类。PCA 结果也再次验证了正品与伪品之间的亲缘远近关系，其中W3 单芽狗脊蕨贯众和W4 狗脊蕨贯众与绵马贯众离散度虽小，但依然能够清晰分开，W1 峨眉蕨贯众、W2 鳞毛蕨贯众和W5 苏铁蕨贯众离散相对较大，总体离散特征与正伪品外观形态相似度十分相符，说明聚类分析和PCA 此两个化学模式识别方法分析绵马贯众正伪品的红外数据特征较为准确。

相对于绵马贯众UPLC、HPLC 和PCR［15-19］等质量分析手段而言，本红外光谱鉴别实验研究方法取样量小，制样简单，分析速度快，并从整体上反应绵马贯众的成分信息，采用化学模式识别分析结果准确，可对市场长期存在的绵马贯众易混淆品种问题进行快速甄别，为实际检验和生产质量的前期控制提供有效手段和科学依据。