一测多评法同时测定健脾丸中4种有效成分的含量

于文玫

健脾丸是由枳实、炒白术、陈皮与党参等多味中药配伍组成的中成药，具有健脾开胃的功效，临床用于治疗食少便溏，脘腹胀满，脾胃虚弱［1］。其中，枳实与陈皮发挥破气消积，理气健脾与化痰散痞的功效［2-3］。党参发挥养血生津与健脾益肺的功效［4］；炒白术发挥固表止汗安胎的功效［5-6］。健脾丸的法定检验标准收载于《国家药品标准》中药成方制剂（第七分册）。经查阅文献［7-8］，其质量控制均是以枳实与陈皮中主要成分检测为主，尚未检索到对健脾丸中白术与党参质量控制的文献报道。党参中特有成分为党参炔苷，白术中特有成分为白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ，通过对此4 种成分含量测定，可以有效控制健脾丸中白术与党参两种处方的质量。

一测多评法（QAMS）是利用样品中某一指标成分作为内参物，建立内参物与其他待测组分之间的相对校正因子（RCF），再利用RCF 计算其他待测组分的含量［9-11］。QAMS 可以解决中药对照品制备难度大，稳定性差，价格昂贵，不容易获得的难题，适合于中药中多成分同时含量测定［12-14］。本研究于2020 年1 月至2020 年7 月采用QAMS 对健 脾丸中4种有效成分进行同时检测，该方法经济实惠方便快捷，较全面地反映健脾丸的质量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂安捷伦1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；岛津LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有二极管阵列检测器。对照品：党参炔苷（批号111732）、白术内酯Ⅰ（批号111975）、白术内酯Ⅱ（批号111976）、白术内酯Ⅲ（批号111978）均由中检院提供；样品：健脾丸（规格为每8 丸相当于原生药3 g，批号191011，181002，190303，200201，仲 景 宛 西 制 药 公 司；191002，200105，上海华源制药公司；批号190504，190903，200204，上海宝龙安庆公司；批号200301，兰州佛慈制药公司），乙腈、甲醇与冰醋酸均为色谱纯，购自德国默克公司，超纯水为实验室自制。

1.2 色谱条件色谱柱为Zorbax SB-C18（250.0 mm×4.6 mm×5μm）；流速为1.0 mL/min；各检测成分的检测波长分别为党参炔苷（270 nm）、白术内酯Ⅰ（220 nm）、白术内酯Ⅱ（220 nm）和白术内酯Ⅲ（270 nm）；柱温为35 ℃；进样量为10 μL；流动相为乙腈（A）-水（含0.1%冰醋酸）（B），梯度洗脱程序：0（20%A：80%B），9 min（50%A：50%B），16 min（55%A：45%B），25 min（100%A）。

1.3 对照品溶液的配制称取各待测成分对照品（党参炔苷99.37 mg，白术内酯Ⅰ15.29 mg，白术内酯Ⅱ10.16 mg 与白术内酯Ⅲ17.93 mg），转移至10 mL 容量瓶中，用甲醇充分溶解后定容，作为对照品储备溶液；量取各对照品储备溶液1 mL，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.4 供试品溶液的配制取健脾丸研碎，称取约2.0 g，转移至具塞三角瓶中，加入100 mL 甲醇，称定重量，加热回流提取1 h，再称定重量，用甲醇补充损失的重量，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.5 阴性对照溶液的配制按照国家法定检验标准中收载的健脾丸处方制法，制备不含白术与不含党参的阴性样品，按照“1.4”供试品溶液的配制方法，配制不含白术与不含党参的阴性样品溶液。

1.6 回归方程与RCF 计算本研究以党参炔苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ与白术内酯Ⅲ4 种对照品储备溶液配制系列标准溶液，进行检测，以待测成分的质量浓度（x，mg/L）作为横坐标，以色谱响应值（y）作为纵坐标，以最小二乘法进行线性统计分析，制得回归曲线方程。并以党参炔苷为内参物，分别计算3种白术内酯的RCF。

2 结果

2.1 系统适用性试验分别取供试品溶液、对照品溶液及不含白术与不含党参的阴性样品溶液，进行检测。4 种待测成分色谱峰的分离度与对称性均良好。在不含白术与不含党参的阴性样品溶液色谱图中无其他杂质色谱峰干扰，说明本研究建立色谱条件适用于4种待测成分的检测。见图1。

2.2 线性与范围取“1.3”项下对照品储备溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，转移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制得标准系列溶液，按照“1.2”项下色谱条件进行检测，再进行线性回归分析，标准曲线方程与相关系数（r）检测结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.3 重复性试验取本品（批号191011），按“1.4”项下制备6 份供试品溶液，进行检测，记录4 种待测成分的响应值并按照标准曲线方程计算各成分的含量。结果，各成分含量的相对标准差（RSD）（n=6）分别为1.02%、1.15%、0.67%、0.82%，说明本研究建立方法具有良好的重复性。

2.4 稳定性试验取本品（批A号 191011），按B“1.4”项下制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h 进行检测，记录4 种待测成分的响应值。结果4 种成分响应值的RSD 分别为0.73%、0.82%、0.66%、0.84%，说明样品溶液在检测时间段内具有良好的稳定性。

图1 高效液相色谱图：A为对照品溶液；B为供试品溶液；C为不含党参阴性样品溶液；D为不含白术阴性样品溶液

2.5 精密度试验量取“1.3”项下对照品溶液，按照“1.2”项下色谱条件进行检测，连续测定6 次，记录4种待测成分的响应值，并计算RSD值；结果各成分响应值的RSD 分别为0.56%、0.74%、0.49% 和0.61%，说明精密度良好。

2.6 回收率试验取样品（批号191011）6 份，称取1.0 g，置具塞三角瓶中，加入“1.3”项下对照品贮备溶液500 μL，分别制备供试品溶液，进行检测，并计算回收率。结果4种待测成分的平均回收率分别为98.16%、97.52%、98.18%、98.13%，其RSD 分别为1.25%、1.05%、1.23%、1.08%。

2.7 RCF和相对保留时间（RRT）的测定

2.7.1 待测组分RCF 计算 按“1.6”项下方法，取“2.2”项下的系列对照品溶液，分别进行检测，各浓度水平的对照品溶液分别进样3 次，计算待测成分响应值的平均值，并计算各成分相对党参炔苷的校正因子。结果见表2。

表2 待测组分相对校正因子

2.7.2 高效液相色谱仪及色谱柱对RCF 的影响本试验分别考察安捷伦1260、岛津LC-20A 高效液相 色 谱 仪 和Zorbax SB-C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Capcell pak C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Accucore C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Thermo ODS C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）等不同型号色谱柱对RCF 的影响，每个样品均平行检测3次，取平均值进行计算，结果见表3。结果表明，不同品牌高效液相色谱仪及色谱柱对RCF无显著影响。

2.7.3 色谱峰的定位 色谱峰的准确定位是使用QAMS 法的前提，本试验选用RRT 对各待测成分进行定位。本研究以党参炔苷为内参物，分别计算白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ与党参炔苷的RRT。分别考察各成分RRT 在不同高效液相色谱仪和色谱柱中的重现性。每个样品均平行进样3次，取平均值进行计算，结果各成分的RRT 变化非常小。采用RRT 对各成分进行定位更为准确，结果见表4。

表4 不同高效液相色谱仪与色谱柱的相对保留时间检测结果

2.8 QAMS 与外标法测定结果的比较为了再次验证本研究建立QAMS 的准确性，本试验对QAMS与外标法测定结果进行比较。取样品，按“1.4”项下制备供试品溶液，进样测定，分别采用QAMS和外标法计算4 种成分的含量，并计算2 种方法测量结果的相对误差，相对误差=（QAMS计算值-外标法实测值）/外标法实测值×100%，结果见表5。对2 种方法检测结果进行t检验，结果2种方法检测含量差异无统计学意义（P＞0.05），且相对误差＜2%。

3 讨论

3.1 内参物的选择及色谱峰定位党参炔苷为党参中特有成分，性质稳定，对照品比较容易获得，因此选择党参炔苷作为内参物。QAMS 法应用的前提是各待测成分色谱峰定位必须准确，通常采用RRT对待测成分进行定位。本试验分别考察了不同品牌的高效液相色谱仪和不同型号的色谱柱对RCF和RRT 的影响，结果表明，采用不同的高效液相色谱仪和不同型号色谱柱，RCF和RRT均非常稳定。

3.2 色谱条件的优化本试验对流动相的组成及梯度洗脱条件进行考察，经过对甲醇与乙腈两种有机相比较，发现甲醇的黏度相对较大，高效液相色谱的柱前压力较高，容易使色谱柱填料塌陷，损坏色谱柱，并且待测成分党参炔苷与相邻成分峰的分离度达不到分度的要求。而乙腈的黏度较低，系统的柱前压力低，不易损坏色谱柱。通过在水相中加入0.1%乙酸，极大改善了各成分色谱峰的对称性。利用二极管阵列检测器的紫外扫描功能，检测各待测成分的最大响应波长。本研究分别采用各成分最大响应的波长进行检测，有效提高了对待测成分检测的灵敏度。

表3 不同高效液相色谱仪及色谱柱的相对校正因子

表5 一测多评法（QAMS）与外标法测得结果比较/（mg/g）

3.3 QAMS 的系统适用性与耐用性本研究利用更换不同品牌的高效液相色谱仪和色谱柱，对所建立方法的耐用性进行考察。通过对安捷伦1260 与岛津LC20A 高效液相色谱仪，以及4 根不同型号的液相色谱柱的RRT 与RCF 测定，结果各成分的RRT与RCF 均具有良好的重现性。本研究选择党参炔苷作为内参物，其主要原因是党参炔苷性质稳定且价廉易得，在节约检测成本的同时，可以实现对多种成分进行同时检测。通过对10 批次的样品进行分析，验证了该方法检测结果与外标法检测结果无显著性差异，证明了该方法准确可靠。

本试验采用QAMS 对健脾丸中党参炔苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ与白术内酯Ⅲ4 种成分进行检测，结果可靠准确，操作方便且经济实惠，可以对多个有效成分进行同时检测，与外标法相比节约了检验的时间和成本，为健脾丸的质量控制提供了一种简便的方法。