黄芪桂枝五物汤不同剂量治疗糖尿病周围神经病变量效关系及对经典Wnt信号通路的影响

刘曼曼,冯珍凤,姜 健,高俊凤,陈见纺,胡春平,严 军

(1.上海市嘉定区中医医院，上海 201899；2.上海中医药大学，上海 201203)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最主要的慢性并发症之一，在新诊断以及病程较长的糖尿病患者中其发病率分别高达8%和53%[1]。目前DPN的发病机制尚未明了，已证实的病理变化包括轴突萎缩、脱髓鞘、神经纤维丧失及神经再生障碍[2]。经典的Wnt信号通路与神经系统密切相关，在神经管的形成、背根神经节及中脑的发育中有重要作用[3]。有研究发现，高糖对经典Wnt信号通路有影响，而信号通路的失调又会进一步加重代谢紊乱[4]。另有动物实验表明，腹腔注射Wnt信号通路激活剂可以激活Wnt信号通路，促进髓鞘再生和轴突再生，有利于糖尿病小鼠溃疡愈合[5]。因此推测经典Wnt信号通路可能在DPN受损神经修复方面可能发挥重要作用。近年来，中医药治疗DPN显示出一定优势。黄芪桂枝五物汤源于汉代名医张仲景撰著《伤寒杂病论》，后记载于《金匮要略》治疗血痹病，原著认为该病本在“阴阳俱微”，标在“加被微风”，病在血脉，气血两亏，经血迟滞难行，肌表失营，遂见“外证身体不仁”，治当扶正以祛邪，温经而通脉，表现与DPN临床表现相符，为治疗糖尿病慢性并发症的名方、经方。大量研究证实，黄芪桂枝五物汤治疗DPN的疗效满意[6-8]，但是多为基于原方基础上化裁加减的研究，且对本方量效、药效深入研究少见。因此本研究以《金匮要略》中黄芪桂枝五物汤原方比例为正常剂量、0.5倍正常剂量为低剂量、1.5倍正常剂量为高剂量干预DNP患者，并以经典Wnt信号通路为核心，探讨不同剂量黄芪桂枝五物汤治疗DPN的量效关系及相关机制。

1 资料与方法

1.1纳入标准 ①符合《中国糖尿病防治指南(2017年版)》[9]中DPN的诊断标准；②中医辨证参考《糖尿病周围神经病变中医临床诊疗指南(2016 年版)》[10]属于气虚血瘀证；③年龄≥18岁，近3个月血糖控制平稳，糖化血红蛋白(HbA1c)≤7.5%；④患者对本研究知情和同意。

1.2排除标准 伴严重心肝肾功能异常者；伴免疫系统疾病者；伴急慢性感染者。

1.3一般资料 选取2018年4月—2020年12月嘉定区中医医院收治且符合上述标准的120例DPN患者进行研究，研究方案经嘉定区中医医院伦理审查(006号)通过。纳入者血糖稳定后，按SAS V9.0软件编制随机安排表分为甲钴胺组、中药低剂量组、中药正常剂量组、中药高剂量组，每组30例，4组患者基线资料比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 4组糖尿病周围神经病变患者性别、年龄、病程比较

1.4治疗方法 甲钴胺组给予甲钴胺片(扬子江药业集团南京海陵药业，国药准字H20052325，规格：0.5 mg×20片)口服，0.5 mg/次，3 次/d，持续治疗12周。中药正常剂量组给予正常剂量黄芪桂枝五物汤口服，即黄芪15 g、白芍15 g、桂枝15 g、生姜30 g、大枣4枚，黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣比例为1∶1∶1∶2∶1.5；中药低剂量组给予0.5倍正常剂量黄芪桂枝五物汤口服；中药高剂量组给予1.5倍正常剂量黄芪桂枝五物汤口服；中药由嘉定区中医医院药剂科统一煎制，1剂取汁450 mL，150 mL/包，三餐后30 min各服1包，持续治疗12周。

1.5观察指标

1.5.1糖代谢指标 治疗前后取4组患者静脉血，检测空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG)、HbA1c。

1.5.2多伦多临床神经病变评分量表(TCSS)评分 TCSS量表包括神经症状6项(下肢麻木、疼痛、针刺样感觉、乏力、走路不稳及上肢相似症状)、神经感觉5项(刺痛觉、温度觉、触压觉、振动觉、位置觉)、神经反射2项(踝反射及膝反射)[11]。神经症状：正常计0分，存在相应症状计1分，共 6 分；神经感觉：正常计0分，异常计1分，共5分；神经反射：双侧均计分正常计0 分，减弱计1分，消失计2分，共8分。治疗前后各评定1次，评分越低表示病变越轻。

1.5.3中医症状积分 主症包括足麻木，如有蚁行，肢末时痛，多呈刺痛，下肢为主，入夜痛甚，神疲倦怠，按症状无、轻、重，每项计0，2，4 分；次症包括气短懒言，腰腿酸软，或面色白，自汗畏风，易于感冒，腹泻或便秘，按无、轻、重，每项计0，1，2 分[10，12]。治疗前后各评定1次，评分越低表示症状越轻。

1.5.4神经传导速度 治疗前后采用RTH861 型数字心脑肌电图仪(德国Merck 公司)检测4组患者腓总神经、正中神经的运动神经传导速度(MNVC)及感觉神经传导速度(SNVC)。

1.5.5血清中经典Wnt信号通路关键分子β-catenin、cyclinD1、c-myc、DKK1 mRNA表达量 利用Real-Time PCR技术检测：治疗前后分别取4组患者清晨空腹静脉血3 mL于惰性胶促凝管中，1 000 r/min离心(离心半径95 mm)10 min，将上层血清分装至RNaseEP管中，冰盒运送，-80 ℃保存备用。使用Trizol试剂提取RNA，按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作，以β-actin为内参基因，校正目标基因的荧光强度，计算得出mRNA相关表达量，进行统计分析。上海东寰生物科技有限公司设计合成研究所需引物，见表2。每个血样按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作提取的mRNA，以β-actin为内参基因，校正目标基因的荧光强度，计算目标基因/β-actin数值。

表2 经典Wnt信号通路关键分子β-catenin、cyclinD1、c-myc、DKK1引物序列

1.5.6临床疗效 治疗12周后评估4组疗效，并记录达到显效、有效的时间。参考《中医病证诊断疗效标准》[13]和《糖尿病中医防治指南》[14]制定疗效评定标准，显效：临床症状体征基本消失，神经传导速度增快超过5 m/s和(或)中医症状积分减少≥90%；有效：症状和体征明显改善，神经传导速度增快3～5 m/s和(或)中医症状积分减少30%～90%；无效：症状和体征未见改善或明显加重，神经传导速度无改善。

2 结 果

2.1糖代谢指标比较 治疗12周后，4组FPG、2hPG、HbA1c均明显降低(P均<0.05)；治疗后组间比较，中药正常剂量组和中药高剂量组FPG、2hPG、HbA1c均明显低于甲钴胺组(P均<0.05)，中药低剂量组与甲钴胺组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 4组糖尿病周围神经病变患者糖代谢指标比较

2.2TCSS评分和中医症状积分比较 治疗12周后，4组TCSS评分(神经症状、神经感觉、神经反射)和中医症状积分均明显降低(P均<0.05)；治疗后组间比较，中药正常剂量组和中药高剂量组TCSS评分(神经症状、神经感觉、神经反射)和中医症状积分均明显低于甲钴胺组(P均<0.05)，中药低剂量组与甲钴胺组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 4组糖尿病周围神经病变患者TCSS评分和中医症状积分比较分)

2.3腓总神经和正中神经MNVC及SNVC比较 治疗12周后，4组腓总神经和正中神经的MNVC及SNVC均明显加快(P均<0.05)；治疗后组间比较，中药正常剂量组和中药高剂量组腓总神经、正中神经的MNVC及SNVC均明显快于甲钴胺组(P均<0.05)，中药低剂量组与甲钴胺组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表5。

表5 4组糖尿病周围神经病变患者腓总神经、正中神经MNVC及SNVC比较

2.4经典Wnt信号通路关键分子mRNA相对表达量比较 治疗12周后，4组血清中β-catenin、cyclinD1、c-myc mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，DKK1 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)；治疗后组间比较，中药正常剂量组和中药高剂量组血清中β-catenin、cyclinD1、c-myc mRNA相对表达量均明显高于甲钴胺组(P均<0.05)，DKK1 mRNA相对表达量均明显低于甲钴胺组(P均<0.05)，中药低剂量组β-catenin、cyclinD1、c-myc、DKK1 mRNA相对表达量与甲钴胺组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表6。

表6 4组糖尿病周围神经病变患者经典Wnt信号通路关键分子mRNA相对表达量比较

2.5临床疗效比较 甲钴胺组总有效率为63.3%，中药低剂量组总有效率为66.7%，中药正常剂量组总有效率为90.0%，中药高剂量组总有效率为93.3%，中药正常剂量组和中药高剂量组总有效率均明显高于甲钴胺组(P均<0.05)，中药低剂量组与甲钴胺组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 4组糖尿病周围神经病变患者治疗12周后临床疗效比较 例(%)

2.6达到显效、有效时间比较 中药正常剂量组、中药高剂量组达到显效、有效时间均明显短于甲钴胺组(P均<0.05)，中药低剂量组达到显效、有效时间与甲钴胺组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表8。

表8 4组糖尿病周围神经病变患者达到显效、有效时间比较

3 讨 论

现代医学研究表明，DPN的发病主要与代谢紊乱、免疫炎症、氧化应激、微循环障碍、神经损伤再生障碍等相关[2]。随着病情发展，DPN可导致足部溃疡、坏疽，甚至截肢，给患者带来巨大痛苦，故早期诊治是改善患者预后的关键。目前西医药治疗DPN方法有限。

DPN属于中医“消渴”和“痹证”范畴，因糖尿病日久，耗伤气阴，阴阳气血亏虚，血行瘀滞，脉络痹阻所致，属本虚标实证。病位在肢体脉络，所涉脏腑为肝、脾、肾等，以气血亏虚为本，瘀血阻络为标[15]。黄芪桂枝五物汤具有益气温补经络、活血通痹之效，正中DNP发病病机，治疗DNP效果突出。该方首载于仲景《金匮要略·血痹虚劳脉证并治篇》：“黄芪三两、桂枝三两、芍药三两、生姜六两、大枣十二枚，以上五味，以水六升，煮取二升，温服七合，日三服。”按汉代计量换算为现代剂量为黄芪45 g、桂枝45 g、白芍45 g、生姜90 g、大枣60 g(12枚)。方中黄芪为君药益气培本，补而兼升，补而兼行，善走肌表，气为血母，又为血帅，补气以养血，补气以行血。桂枝色赤，专入营血之分，性温擅通，鼓舞气血，正旺自可祛邪。芍药酸甘养血，姜枣入脾胃，健中促运，滋气血生化之源。药仅五味，专谋气血，气血旺则血脉通，气血足则顽麻除。目前的临床研究中该方剂用量多为在原方基础上进行药味、剂量加减后形成处方，对其具体每日用量无相关医家进行整理研究。而中医药治疗优势在于辨证论治，药物剂量配伍是重要因素。仝小林院士曾在“理-法-方-药”基础上提出“量效”理论，但目前关于该方面的临床标准化研究报道较少，大多应用于动物实验中，故对经方、名方的经典剂量配伍的传承研究具有重要意义。

本课题组查阅大量古籍有关剂量研究，根据《后汉书·律历志上》中记载用药剂量“量者，龠、合、以量多少也。合龠为合，十合为升，十升为斗，十斗为斛，而五量嘉矣”，推算黄芪桂枝五物汤古籍中一日用量为黄芪三两、桂枝三两、芍药三两、生姜六两、大枣十二枚药量的7/20，因为慢性病，故日三服，每次用量为7/20再等分为三，故本研究中延用原方剂量取一日剂量的7/20为正常剂量，约等于黄芪15 g、白芍15 g、桂枝15 g、生姜30 g、大枣4枚，同时以1.5倍正常剂量为高剂量，以0.5倍正常剂量为低剂量。结果显示，治疗12周后，中药各组FPG、2hPG、HbA1c及神经症状、神经感觉、神经反射积分均明显降低，肢体麻、凉、痛等症状均明显改善，腓总神经、正中神经的MNVC及SNVC均明显加快；且与甲钴胺组比较，中药正常剂量组和中药高剂量组各指标改善更明显，治疗总有效率更高，达到显效、有效的时间更短。提示黄芪桂枝五物汤原方配伍比例可修复DPN患者的运动及感觉神经功能，并在一定剂量范围内随着剂量增大作用越明显。

近年研究表明，经典Wnt信号通路的相关基因表达在高糖环境下会发生变化，而信号通路的失调又会进一步加重糖脂代谢紊乱，形成恶性循环[4]。赵亚男等[16]动物实验发现糖尿病大鼠皮肤溃疡组织中Wnt/β-catenin信号通路mRNA和蛋白表达量显著降低，并导致了糖尿病溃疡难以愈合。张珍等[17]给予DNP小鼠注射Wnt信号通路抑制剂XAV-939，发现DNP小鼠经典Wnt通路相关基因 β-catenin、c-myc、线粒体转录因子A(TFAM)mRNA的表达量较模型组降低，因此推断经典Wnt信号通路受到抑制后会加重DNP。张珍[18]另一项研究显示，相较于正常人，2型糖尿病及DPN 患者经典Wnt通路下游基因 β-catenin、cyclinD1、c-myc表达量明显降低，负性调控分子DKK1表达量明显升高，提示经典 Wnt信号通路功能降低可能促进 DPN的发生。本研究发现，黄芪桂枝五物汤可上调β-catenin、cyclinD1、c-cmyc mRNA表达，下调DKK1 mRNA表达，且正常剂量和高剂量调节作用明显优于甲钴胺。提示黄芪桂枝五物汤可能通过激活经典Wnt信号通路促进神经纤维修复及再生，从而发挥神经保护作用。

综上所述，黄芪桂枝五物汤在一定剂量范围内可明显减轻糖尿病周围神经病变气虚血瘀证患者症状，改善神经传导功能，修复周围神经，且疗效呈剂量依赖性提高，其作用机制可能与激活经典Wnt信号通路有关。但黄芪桂枝五物汤中不同的量效配伍关系及分子生物学机制尚需进一步研究证实。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。