平喘颗粒对哮喘小鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路的影响

郅扶旻，李竹英，田春燕，徐洪涛

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

支气管哮喘简称哮喘，是呼吸科常见和多发病之一，影响着全球3亿多人健康[1]。我国是哮喘发病率较高的国家之一，流行病学调查显示，在过去10年间14岁以上的人群哮喘患病率处于增高趋势[2]，哮喘发病率升高而控制率较低是我国面临的严峻问题。哮喘是多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，气道炎症是导致哮喘发病的最根本原因，与气道重塑和气道高反应性密切相关。近年多项研究发现，中药在改善症状、减轻气道炎症及延长发病时间方面有明显优势。平喘颗粒为黑龙江中医药大学附属第一医院呼吸科经验方自制剂，前期研究证实该药可降低Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、嗜酸粒细胞趋化因子(Eotaxin)、嗜酸性粒细胞趋化因子受体(CCR3)及相关炎症因子的表达，可有效减轻哮喘气道炎症[3-6]。但研究的重点主要在受体蛋白、炎症因子及趋化因子等方面，在通路机制方面研究较少。NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白细胞介素-1β(IL-1β)与哮喘炎症反应密切相关，是导致炎症反应形成的关键通路，本研究从NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路着手，进一步探讨了平喘颗粒治疗哮喘的可能机制，旨在为其临床应用提供更多理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级雌性C57BL/6小鼠40只，体重(20±2)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。小鼠饲养于温度(23±2)℃、湿度(50±6)%的动物房，自由饮水、摄食，适应性喂养1周。本研究严格遵守国家爱护动物和使用实验动物研究的相关规定，动物实验经黑龙江中医药大学伦理委员会批准。

1.2药物、试剂与仪器 平喘颗粒(由淫羊藿200 g、太子参150 g、黄芪150 g、五味子150 g、知母100 g、炙麻黄100 g、款冬花150 g、罂粟壳40 g、地龙100 g组成，黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室，10 g/袋，批号：20180723)，吸入用布地奈德混悬液(澳大利亚 Astia-zeneca PtyLtd，注册证号H20140475)；卵蛋白(美国Sigma公司，货号：A5253)，氢氧化铝佐剂(美国赛默飞公司，货号：77161),HE染色试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：20181103)，白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-18(IL-18)酶联免疫试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E04639m，CSB-E04609m),SYBR Premix Ex Taq试剂盒和转录试剂盒(日本 Takara 公司，货号：RR420，639503)；超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司，型号：402AI)，组织包埋机(美国Thermo公司，型号：TEC2800),石蜡切片机(德国Leica公司，型号：RM2235)，电子显微镜(日本HITACHI，型号：Hitachi7180)，酶标仪(美国Thermo，型号：Multiskan MK3),PCR仪(美国Bio-Rad公司，型号：CFX96)。

1.3实验方法 将40只健康雌性小鼠随机分为空白组、模型组、布地奈德及平喘颗粒组，每组10只。模型组、布地奈德组及平喘颗粒组小鼠于实验第1，7，14天腹腔注射卵蛋白+氢氧化铝混合液250 μL致敏，于第21天给予2%卵蛋白溶液进行雾化激发，每次雾化30 min，每周持续5 d，连续激发6周。从致敏的前1 d开始，布地奈德组给予布地奈德混悬液0.5 mg/mL雾化吸入30 min，平喘颗粒组给予平喘颗粒药液31.2 g/kg灌胃，空白组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃,均1次/d，连续干预4周。

1.4标本采集与检测

1.4.1肺组织HE染色 末次干预结束后，以3%戊巴比妥钠溶液麻醉处死小鼠，打开胸腔暴露肺组织，将右肺组织切块后脱水，置于二甲苯和石蜡透明、包埋，将蜡块切成5 μm的肺组织切片。将切片脱蜡，然后在苏木精染色液中浸泡3 min，水洗后在伊红染色液中浸泡3 min，酒精脱水至透明，然后封片置于显微镜下观察染色情况。

1.4.2肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平 小鼠处死后仰卧位固定，分离主支气管，打开胸腔暴露肺组织。结扎右主管，注射器抽取0.5 mL生理盐水刺入主气管，注入生理盐水后回抽，以上操作进行3次，共收取1.5 mL的肺泡灌洗液，然后离心收集上清液。按照ELISA试剂说明书进行操作，检测肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平。

1.4.3肺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达量 采用RT-qPCR法检测：按照提取试剂盒的步骤提取总RNA，将提取的总RNA反转录cDNA，并进行PCR扩增。NLRP3引物：上游5’-CCAGATGGAGAAGGCAGATCACTTG-3’，下游5’-TCGCAGCAAAGATCCACACAGC-3’；Caspase-1引物：上游5’-TCTGTATTCACGCCCTGTTGGAAAG-3’，下游5’-CTCTTTGCCCTCAGGATCTTGTCAG-3’；IL-1β引物：上游5’-CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3’，下游5’-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3’；β-actin引物: 上游5’-TGATGGGTGTGAACCACGAG-3’，下游5’-GCCCTTCCACAATGCCAAAG-3’。PCR的循环条件：95 ℃ 30 s预变性，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s)×30个循环，以β-actin为内参，以2-ΔΔct计算目标基因的相对表达量。

2 结 果

2.1各组小鼠肺组织HE染色表现 空白组小鼠肺泡结构基本正常，无明显炎症细胞浸润；模型组小鼠肺泡结构破坏，可见大量炎性细胞浸润，间隔水肿增厚；与模型组相比，布地奈德组及平喘颗粒组小鼠支气管周围及血管外周炎症细胞浸润情况明显好转。见图1。

图1 空白组和哮喘各组小鼠肺组织HE染色表现

2.2各组小鼠肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平比较 模型组IL-6和IL-18水平均明显高于空白组(P均<0.05)；平喘颗粒组和布地奈德组IL-6和IL-18水平均明显低于模型组(P均<0.05)；平喘颗粒组IL-6水平明显低于布地奈德组(P<0.05)，而IL-18水平明显高于布地奈德组(P<0.05)。见表1。

表1 空白组和哮喘各组小鼠肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平比较

2.3各组小鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较 模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；平喘颗粒组和布地奈德组NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)；平喘颗粒组NLRP3 mRNA相对表达量明显低于布地奈德组(P<0.05)，Caspase-1和IL-1β mRNA相对表达量与布地奈德组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

3 讨 论

气道炎症是哮喘发作的病理基础,是哮喘出现临床症状的重要原因，通过抑制气道炎症能够有效减轻气道高反应性，达到并维持哮喘的临床控制，改善肺通气功能，降低急性发作频率，提高患者生活质量，最终降低病死率[7-8]。然而气道炎症作为呼吸系统疾病的常见致病因素，其病机研究尚未清晰，尚无有效治愈手段，故寻找治疗的新思路、新靶点刻不容缓[9]。哮喘的发生与发展由多种炎症细胞和免疫细胞参与，各种损伤和病原体侵犯呼吸系统的第一道防御屏障是气道上皮细胞，而哮喘患者气道上皮细胞内外皆有炎症小体的不同程度表达[10]。

炎症小体作为固有免疫的重要组成，在机体免疫反应和炎症性疾病发生过程中具有重要作用[11]。NLRP3炎症小体是一种细胞内传感器，参与固有免疫，在多种免疫细胞触发下产生慢性炎症反应，参与哮喘慢性气道炎症的发生发展[12-15]。Ather等[16]研究显示，卵蛋白诱导的哮喘小鼠血清淀粉样蛋白A水平显著升高，可直接激活NLRP3炎症小体，加重哮喘症状。另外NLRP3可通过感知信号刺激并作为支架蛋白结合ASC，ASC招募并水解前体pro-caspase-1，形成具有酶活性效应蛋白酶Caspase-1，然后导致促炎症细胞因子如pro-IL-1β裂解和成熟为其活性物质IL-1β，以及下游炎症因子IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺素和白三烯等表达升高，诱导免疫反应，参与哮喘发作[17-18]。朴艺花等[19]在乱蛋白诱导的哮喘小鼠模型中，发现NLRP3的激活可诱导IL-1β、IL-18、IL-6呈高表达，NLRP3不仅可以诱发哮喘，还可以协同Caspase-1/IL-1β信号通路进一步加重气道炎症。IL-1β作为NLRP3炎症小体的效应物，是一种多能促炎因子，参与气道炎症，并在肺部炎症发病中起关键作用[20]。Rincon等[21]研究表明，活动性哮喘患者肺泡灌洗液中IL-6水平明显升高。上述研究显示，NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的激活参与了哮喘气道炎症的发生，故本研究认为通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路可减轻哮喘气道炎症以及气道高反应性。平喘颗粒组方中淫羊藿、炙麻黄为君药，共同发挥温补肺肾二脏阳气之功，以达温阳平喘之效。太子参、黄芪补气同时亦能生津，在助君药温阳的同时又防止津液耗伤太过；五味子、款冬花、地龙敛肺止咳、化痰平喘，以上5味共为臣药。罂粟壳酸涩收敛，敛肺止咳的同时助君药敛久耗之肺气，用为佐药。知母润肺止咳，引药入肺肾二经，为方中之使药。诸药合用，肾阳得补、脾气得健、肺气得宣，从而达到益气温阳、化痰平喘之功。Tian等[22]研究证实，淫羊藿中的主要活性化合物淫羊藿苷能够通过调控NF-κB和STAT3信号通路抑制嗜酸性粒细胞诱导的气道炎症和气道重塑。王珏等[5-6]研究发现平喘颗粒能够通过调控TLR2、TLR4表达抑制Th2细胞活化，进而改善气道炎症，同时可通过抑制miR-21的表达降低嗜酸性粒细胞的表达，从而减轻气道炎症。

本实验研究结果显示，模型组小鼠肺组织HE染色显示气道炎症浸润明显，肺泡灌洗液中 IL-6、IL-18水平和肺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量均明显升高；而平喘颗粒组小鼠气道炎症浸润明显减轻，肺泡灌洗液中 IL-6、IL-18水平和肺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量均明显降低。提示平喘颗粒可能通过抑制NLRP3炎症小体激活，从而抑制Caspase-1、IL-1β转化为活性生物物质，进而下调IL-6和IL-18的表达，起到减轻气道炎症、控制疾病发展的作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。