醒神健脑方对非痴呆性血管性认知障碍大鼠同型半胱氨酸及氧化应激反应的影响

郭闫葵,卢文文,张晓燕

(1.济南市中医医院，山东 济南 250012；2.山东中医药大学，山东 济南 250355)

非痴呆性血管性认知障碍(VCIND)是血管性认知障碍的早期阶段,多项研究证实高同型半胱氨酸(Hcy)是VCIND的独立危险因素[1-2],且Hcy水平与认知功能障碍程度呈正相关[3],故对其监测及干预有重要研究价值。醒神健脑方具有补肾泄浊的功效，已在临床应用多年。为进一步揭示醒神健脑方的具体作用机制，本实验首先根据Hcy由蛋氨酸代谢产生的机制,通过蛋氨酸饲料喂养建立大鼠高Hcy血症模型,再筛选产生VCIND动物模型，观察大鼠行为学及血Hcy、氧化应激指标的变化，探讨该方改善认知功能的作用机制，从而为VCIND的临床防治提供新思路。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 60只SD雄性大鼠,体重约250 g,7周龄,购于济南朋悦实验动物繁育有限公司,许可证号:SCXK(鲁)20190003。饲养于山东中医药大学动物中心清洁级动物房内,饲养温度20～25 ℃,湿度维持在50%～60%,昼夜节律正常,自由进食饮水,每周更换1～2次垫料。在正式实验前普通饲料喂养1周,并且所有实验操作均符合动物伦理要求。

1.2实验药物 3%蛋氨酸饲料由北京科奥协力公司生产。醒神健脑方(由制首乌12 g、女贞子12 g、当归10 g、胆南星10 g、川芎15 g、菖蒲10 g、远志6 g、郁金10 g、赤芍12 g、丹参15 g、地龙10 g、黄芩10 g、陈皮6 g组成)由济南市中医医院制剂室制备为丸剂,制备方法：制首乌、女贞子加水2 000 mL,浸泡60 min,煎煮60 min,取煎液,备用，其余12味药粉碎至100目。起模,用上药煎液作为赋型剂,泛制法制丸,干燥,灭菌,包装。实验前用蒸馏水将丸剂制备成0.3 g/mL(4.5 g/kg)的混悬液,约为成人(70 kg)用量的1.25倍。

1.3试剂和仪器 灭菌毛细管(济南凯博)，EP管(济南凯博)，水合氯醛(济南凯博)，大鼠Hcy ELISA试剂盒(上海科顺)，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法,南京建成)，丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法,南京建成)，一氧化氮(NO)测定试剂盒(酶法/比色法,南京建成)，96孔酶标板(南京建成)；台式冷冻离心机(eppenddorf 5424R/5810R)，水浴恒温振荡器(上海龙跃)，恒温孵育箱(上海龙跃)，全波长酶标仪(BioTek Cytation 5)，漩涡混合器(VORTEX-5)，微量移液器(eppenddorf)。

1.4实验方法 将60只大鼠随机分为3组,每组20只。空白组喂普通饲料，模型组和醒神健脑方组喂3%蛋氨酸饲料,连续3个月，剔除Hcy<12.94 μmol/L大鼠,然后进行水迷宫检测排除肢体残疾、视力障碍及先天愚笨大鼠，以空白组大鼠的平均逃避潜伏期为标准[1]进行筛选,超过其20%的视为造模成功。最终空白组7只、模型组12只、醒神健脑方组11只纳入研究。之后醒神健脑方组大鼠给予醒神健脑方混悬液4.5 g/kg(1 mL/100 g)灌胃,模型组、空白组给予等量蒸馏水灌胃，均1次/d，连续灌胃14 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1行为及认知功能 Morris水迷宫实验：水迷宫测试前将大鼠提前30 min搬运至行为学实验室内以适应环境,并确保每日在固定时间测试。实验前准备:将平台(直径约12 cm)放置于水池(直径约120 cm,深度约50 cm)第四象限内,水池内蓄水,水温保持在20～22 ℃,水面在平台上方2～3 cm,几何图形悬挂在水池周围的帘子上作为空间参考。在SuperMaze软件上设置相关参数及标记平台位置后,在水中放入食用黑色素以隐蔽平台。操作过程中开红光照射,并以帘子遮挡光线,期间保持周围环境安静,避免光线和声音对实验结果的干扰。实验共历时6 d。①定位航行实验:共5 d，训练时间设置为120 s，测量指标为逃避潜伏期。测试时选取Morris水迷宫任意象限任意一点，将大鼠面朝池壁扔入水中,追踪并记录其找到平台所花费的时间,记为逃避潜伏期。若大鼠在120 s内成功寻上平台,则在台上停留10 s；若超过120 s，将其拎上平台并保持15 s(潜伏期记为120 s)。每个入水点视为一次训练，每日训练2次，2次训练之间间隔15～20 min，取2次训练数据均值作为当天学习成绩。②空间探索实验:第6天,将水中平台撤去,记录大鼠在120 s内进入第四象限(目标象限)的次数及停留时间。

1.5.2血液学指标 采血前禁食12 h,自由饮水。使用10%水合氯醛麻醉大鼠,待其四肢瘫软后,剪去胡须以防止溶血,左手固定并压迫大鼠颈部,使静脉充盈,出现眼球突出征象后,右手持灭菌毛细管,45°旋转刺入大鼠内眦眼眶后壁,感到阻力后,将毛细管略往后退,血液即流入毛细管内,以EP管接放血液。血液在室温下静置1～2 h后，放入4 ℃冰箱凝固过夜，次日将血液以2 000～3 000 r/min离心15～20 min，然后分离血清。按说明书检测血清Hcy、SOD、MDA、NO水平。

2 结 果

2.1各组大鼠逃避潜伏期比较 各组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短,除第4天外,空白组和醒神健脑方组大鼠的逃避潜伏期均明显短于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组及非痴呆性血管认知障碍各组大鼠逃避潜伏期比较

2.2各组大鼠空间探索实验结果比较 空白组和醒神健脑方组大鼠进入目标象限次数均明显多于模型组(P均<0.05),目标象限停留时间均明显长于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组及非痴呆性血管认知障碍各组大鼠空间探索实验结果比较

2.3各组大鼠血清Hcy水平比较 灌胃结束后，空白组血清Hcy水平无明显变化(P>0.05),模型组、醒神健脑方组血清Hcy水平均有不同程度的下降(P均<0.05),且醒神健脑方组明显低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 空白组及非痴呆性血管认知障碍各组大鼠血清Hcy水平比较

2.4各组大鼠血清SOD、MDA、NO水平比较 与空白组比较,模型组大鼠血清SOD、NO水平均明显降低(P均<0.05)，血清MDA水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较,醒神健脑方组大鼠血清SOD、NO水平均明显升高(P均<0.05)，血清MDA水平明显降低(P<0.05)。见表4。

3 讨 论

食物中的蛋氨酸摄入体内之后,先合成S-腺苷蛋氨酸(SAM),SAM的甲基高度活化,在相关酶作用下,把甲基转移到DNA、肾上腺素和神经递质上,然后自身变成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),最后进一步脱腺苷生成Hcy[4]。维生素B12和叶酸由食物摄入，充当人体内催化反应的酶和辅助因子。在正常情况下，Hcy、酶和辅助因子处于相互调节的平衡中，若大量摄入含有蛋氨酸的食物或是因为遗传、性别、年龄、药物等影响打破此平衡，辅助因子相对减少，超出代谢负荷的Hcy累积，表现为高Hcy血症。目前动物实验中多采用高浓度蛋氨酸来制备高Hcy模型,喂养方式以灌胃、饮水、普通饲料+蛋氨酸为主,浓度多采用1%，1.5%，2%，3%等[5-7]。结合文献及实验要求,本实验采用3%蛋氨酸饲料喂养大鼠，使大鼠体内蛋氨酸代谢负荷而出现Hcy蓄积,建立高Hcy血症模型。高Hcy可通过抑制体内抗氧化酶活性、促进氧自由基的过度生成和阻碍脂质代谢等作用,引起血管内皮损伤,导致氧化应激、平滑肌增生、凝血机制失衡等一系列反应,使血液循环障碍,脑部供血不足，认知受损[8]。另外，高Hcy可阻碍SAH正常代谢，引起SAH增高，而SAH具有强效抑制甲基转移酶活性的作用,可阻碍脑组织内的甲基化过程,引起神经元损伤及细胞凋亡[9]；过量的Hcy代谢反应产生大量活性氧(ROS)，大量ROS使机体的抗氧化能力处于超负荷状态，继而引起神经元细胞凋亡，即氧化应激反应[10]。当ROS氧化作用发生在血管内皮细胞，使内皮细胞的膜通透性增加，细胞凋亡，势必会影响血管的循环运输作用，大脑灌注不足，氧气与能量缺乏，加剧神经元功能的缺失和不足；高Hcy的高反应性可过度激活N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体,产生兴奋性毒性,引起氧自由基产生和Ca2+超载,进而破坏神经元突触可塑性,加速神经元功能退化[11]；高Hcy还可抑制SAM生成,导致体内甲基提供不足,影响神经递质和DNA等物质生成，增强β淀粉样蛋白毒性[12]；当体内的Hcy(SAH水解产生)超出代谢负荷而大量堆积时，作为甲基供体的SAM就会减少，进而引起神经递质合成减少，神经信号传递受阻，引起认知功能障碍[12]。有动物实验证实，高Hcy可改变海马基因表达,导致与认知相关的神经活动配体-受体神经通路甲基化水平下降,引起大鼠认知功能下降[13]；亦可通过影响突触可塑性,损伤海马认知区域及降低内源性营养因子等作用导致大鼠认知功能下降[14]。由此可见，利用高Hcy制备VCIND模型具有实操可能性。

在正常情况下,体内的氧化和抗氧化作用保持动态平衡,以维持机体的正常功能。氧化应激反应可通过损伤血管和神经元等多种途径引起认知障碍。Hcy浓度过高时可抑制体内抗氧化酶的活性,使ROS异常蓄积，导致内皮活性物质NO失活，促进炎症因子黏附,影响血管内皮功能,导致血液循环受阻,脑组织灌注不足,出现认知障碍[15-16]。ROS还能以生物膜为靶点,不断攻击膜上的蛋白质、脂质，导致蛋白质和脂质过氧化,破坏神经细胞结构和功能；攻击DNA等核酸大分子,可引起DNA突变,引起神经退行性病变[17]。另外ROS攻击脂质所产生的主要代谢产物MDA还能反作用于线粒体呼吸链,引起能量循环障碍,进一步加剧氧化应激损伤[18],引起神经元凋亡。氧化应激参与认知障碍病理机制的多个环节,对其干预治疗有助于改善认知功能。SOD是人体内主要的抗氧化酶之一,可催化超氧阴离子,引起歧化反应,抑制体内氧自由基的过度氧化[19-20]；MDA是脂质氧化的最终代谢产物,可体现脂质出现氧化损伤的程度[21]；NO是血管内皮释放的重要活性物质,具有舒张血管、抗血小板聚集等作用,自由基产生过多时可导致其氧化失活,含量降低,可反映血管内皮功能[22],并侧面反映氧化应激损伤程度。

本课题组在查阅大量文献和前期研究的基础上，提出肾阴亏虚是VCIND发生与发展的根本原因，痰浊瘀血内蕴、酿生浊毒为发病过程中的基本环节，据此制订了补肾泄浊的治疗原则，创立醒神健脑方用于VCIND的治疗。本实验结果显示,与空白组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长,大鼠进入目标象限次数减少，目标象限停留时间短，血清Hcy、MDA水平明显升高,SOD、NO水平明显降低，证实高Hcy可破坏体内氧化与抗氧化平衡,引起氧化应激反应,影响大鼠学习记忆功能。与模型组比较，醒神健脑方组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，大鼠进入目标象限次数增多，目标象限停留时间延长，血清Hcy、MDA水平明显降低,SOD、NO水平明显升高，说明醒神健脑方可通过增强体内抗氧化酶的活性,抑制自由基过度生成,减轻氧化应激损伤,改善大鼠认知功能。

综上所述，醒神健脑方可提高VCIND大鼠的学习记忆能力,其机制与降低血清Hcy水平,减轻氧化应激反应有关。但模型组大鼠未进行药物干预血清Hcy有一定降低，考虑模型存在些微不稳定性，另外本实验样本量少,有待扩大样本量、延长观察时间进一步研究验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。