穿心莲内酯对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和迁移的影响*

徐 辉，焦响乐，郑玉宽，杨 静，郭 慧，李晓天

(1.郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450052；2.郑州大学药学院，河南 郑州 450066)

穿心莲内酯属于二萜内酯类化合物，是穿心莲的主要效用成分之一，味苦性寒，主要功效是清热解毒消肿。一般将穿心莲干燥的地上部分作为药用，并在采摘后晒干[1]。现有研究表明,已从穿心莲中分离出的有效化合物主要是二萜内酯类和黄酮类，其中的代表物质就是穿心莲内酯[2]。临床已将其用于炎症和病毒性疾病的治疗，常与抗生素联用[3-4]。近几年,还发现了其更多的功效，如解热、抗心脑血管疾病、免疫调节作用、保肝、降血糖、保护神经等[5-9]，但是关于其抗肝癌的作用研究较少。中医治疗肝癌的药物有丹参、藏红花，药物成分有姜黄素、大果山楂总黄酮、银杏叶提取物、苦参素、甘草甜素、茶多酚，复方制剂有柴胡汤、枣杞汤、解毒胶囊等。这些药物通过抑制肿瘤增殖及转移、调控肝细胞自噬、防止肝细胞变性坏死、减少胶原纤维产生、增强胶原酶的活性、改善肝脏微循环等途径对肝癌进行防治[10-14]。也有学者认为肝癌发病与气滞、血瘀、湿热等病理因素瘀滞肝络所形成的癌毒有关。现代药理学研究表明，清热解毒中药治疗肝癌能改善患者临床症状及体征,其机制与抑制肿瘤增殖及转移、联合化疗药物增强疗效、减轻化疗药物不良反应等有关[15-17]。本文研究穿心莲内酯对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和迁移的影响，以期为穿心莲内酯应用于肝癌治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品、试剂与仪器

穿心莲内酯，大连美仑生物技术有限公司产品，批号D1225A。DMEM培养基，北京索莱宝科技有限公司产品，批号12100-500；胎牛血清，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司产品，批号SV30087.01；无血清细胞冻存液，苏州新赛美生物科技有限公司产品，批号C40010；胰蛋白酶消化液，上海碧云天生物科技有限公司产品，批号C020；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司产品，批号KGA107。Cell Counting Kit-8(CCK-8)，美国安诺伦生物公司产品，批号K1018；结晶紫染色溶液，北京雷根生物技术有限公司产品，批号1109A20；多聚甲醛溶液，北京兰杰柯科技有限公司产品，批号70071800。微量移液枪，德国艾本德公司产品；MiLLiPORE超纯水机，上海乐枫生物科技有限公司产品；Spectra Mr型全波长酶标仪，美国丹耐克斯公司产品；TS2-S-SM型光学电子显微镜，日本尼康公司产品；HH-4恒温水浴锅，江苏金坛市环宇科学仪器厂产品;88600V63型-80 ℃冰箱;318564-4236型细胞CO2培养箱，美国赛默飞世尔科技公司产品。

1.3 细胞培养与处理

HepG2细胞株采用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，培养于37℃、50 mL/L CO2恒温培养箱中。当细胞融合达到75%～85%，用胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.4 检测指标

1.4.1 HepG2肝癌细胞增殖活性

采用CCK-8法检测穿心莲内酯对HepG2肝癌细胞增殖活性的抑制作用。实验原理：电子载体1-Methoxy PMS存在时，CCK-8中的WST-8被还原为橙黄色甲瓒产物，440 nm波长处用酶标仪测定吸光度(OD)值，活细胞的数量与OD值成正线性关系。在96孔板的实验孔中滴加100 μL(约5×103个)细胞悬液，置于CO2恒温培养箱中培养24 h。实验孔加入不同质量分数(0、5、10、20、30、40、50、60 mg/L)的穿心莲内酯溶液，每个质量分数设置3个复孔，放置于培养箱中孵育24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在培养箱中孵育1～4 h，取出在440 nm用酶标仪测量吸光度。细胞抑制率(%)=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100

其中As为实验组吸光度，Ab为空白组(含有CCK-8和培养基)吸光度，Ac为对照组(含有细胞、培养基和CCK-8)吸光度。

1.4.2 HepG2肝癌细胞凋亡

采用Annexin V-碘化丙啶(PI)双染法。被FITC标记的Annexin V可与凋亡细胞结合，用于区分正常细胞与凋亡细胞；PI是能区分死细胞和凋亡晚期细胞的核酸染料。故Annexin V-FITC和PI联用可将凋亡早期与凋亡晚期细胞区分。收集HepG2细胞并接种于6孔板中，24 h后弃去培养基，换用不同质量分数(0、5、10、25 mg/L)含药穿心莲内酯培养基,继续培养24 h。然后,胰酶消化细胞并加入完全培养基，混匀后转移至离心管中；以105 mm为离心半径，以1 000 r/min转速离心5 min；吸除离心管内的上清；用1 mL 4 ℃预冷的PBS溶液轻轻地重悬细胞，并计数；按以上条件再次离心并吸除上清，重悬细胞，离心，吸除管内上清。用 250 μL 稀释过的结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106/mL；取5 mL流式细胞管，将细胞悬液100 μL和Annexin V-FITC溶液5 μL加入其中，混合均匀；置室温(20～25 ℃)避光孵育 10 min；向流式管中加入10 μL PI溶液，并轻轻混匀；重悬细胞,在避光环境中保存，用流式细胞仪立即检测细胞凋亡率。显示为绿色荧光的是Annexin V-FITC，显示为红色荧光的是PI。

1.4.3 HepG2肝癌细胞迁移能力

采用Transwell细胞迁移实验。先将小室活化,向24孔板中加入200 μL的含100 mL/L血清的DMEM培养基；再将Transwell皿放入24孔板中,浸透小室的底部；并将24孔板置于37 ℃环境中孵育1 h；分别取200 μL 质量分数为0、4、8、10 mg/L的细胞悬液铺于上室,置于适宜环境的培养箱中,孵育48 h；取400 μL质量分数为40 g/L的多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS溶液清洗3遍；取1个24孔板，滴加400 μL质量分数为1g/L的结晶紫染色液，染色10 min；将上室中的细胞用洁净的棉签擦净，于电子显微镜下拍照。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 穿心莲内酯对HepG2肝癌细胞增殖活性的影响

随着穿心莲内酯质量分数的增加及作用时间的延长，HepG2肝癌细胞活性逐渐下降。与0 mg/L穿心莲内酯对比，各穿心莲内酯组的吸光度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，穿心莲内酯能抑制HepG2肝癌细胞的增殖活性，且具有时间和浓度依赖性。见表1。

表1 两组不同质量分数的穿心莲内酯对HepG2肝癌细胞增殖活性的影响

2.2 穿心莲内酯对HepG2肝癌细胞凋亡的影响

在穿心莲内酯质量分数0～25 mg/L范围内，随着质量分数增加，HepG2肝癌细胞凋亡率(Q2+Q3)不断增加。在穿心莲内酯质量分数为 25 mg/L时，凋亡率达到(12.70±1.78)%。见图1。结果表明，穿心莲内酯可以促进HepG2肝癌细胞的凋亡。

2.3 穿心莲内酯对HepG2肝癌细胞迁移的影响

经过穿心莲内酯作用48 h，0 mg/L穿心莲内酯组的HepG2肝癌细胞穿过半透膜进入下室的细胞数量明显多于其他各给药组。与低剂量组对比，高剂量组HepG2肝癌细胞穿过半透膜进入下室的数量明显减少。结果表明，随着穿心莲内酯质量分数的增高，穿心莲内酯抑制HepG2肝癌细胞迁移的能力增强。见图2。

3 讨 论

肝癌分为原发性肝癌和转移性肝癌，较为常见的是原发性肝癌。因肝脏富含血管等原因，肝癌的恶性化程度极高。手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、肝脏切除或肝脏移植治疗是治疗肝癌的主要方式。肝癌的早期确诊比较困难，晚期时的手术治疗仅对符合身体条件的少数人适用；放射治疗易对正常肝细胞造成较大损伤从而影响其正常功能[18]；而化学药物治疗常伴随耐药性等相关问题。目前，已明确的水源污染、食物中的毒素、吸烟酗酒，甚至肥胖和糖尿病等均为诱发肝癌的重要因素[19]。从细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭迁移或分子水平探讨肝癌的发生机制是当今肝癌研究的热点、重点和难点。

穿心莲内酯及其衍生物对肿瘤具有一定治疗作用，其机制可能是使淋巴细胞抗癌活性提高，对肿瘤细胞增殖进行抑制，诱导了肿瘤细胞凋亡等，可用于各种肿瘤的治疗。李曙光等[20]的研究表明，穿心莲内酯对BGC-823细胞的增殖具有明显的抑制作用，可以使细胞分裂停滞在G0/G1期，并能促进该细胞的凋亡过程，具有极强的抗癌作用。许洪彬等[21]为了探究穿心莲内酯潜在的作用机制，利用反向分子对接技术和网络药理学分析方法，创建穿心莲内酯抗肿瘤作用的靶标-通路网络，经PharmMapper预测和筛选、KEGG富集析等分析得知，穿心莲内酯主要作用于肝细胞癌、前列腺癌、非小细胞癌等癌症，其通路主要有PIK3R1、SRC、BRAF、EGFR、MMP2、CASP3等靶蛋白，尤其对肝细胞癌专一性高、作用最强。有学者[22]也证明了穿心莲内酯有促进细胞凋亡的作用，可用于治疗肝癌。

人HepG2肝癌细胞是研究体外外源性物质代谢和肝脏恶性肿瘤的良好模型，因为HepG2肝癌细胞所含的生物转化酶与人正常肝实质细胞具有同源性，分化程度较高，并且保留了较完整且活性稳定的生物转化代谢酶[23]。

细胞增殖与凋亡过程的紊乱与肿瘤的发生发展有一定关系。凋亡最开始的表现是细胞皱缩，又称凋亡性细胞容积减少，是细胞凋亡过程中的重要环节[19，24]。在生物机体细胞的生长和繁殖过程中，细胞凋亡具有十分重要的作用，体现了组织修复的重要功能。细胞凋亡是细胞自主性程序死亡，是细胞的主要死亡方式之一，其受多基因严格调控。诱导肝癌细胞凋亡在肝癌治疗中十分重要[25]。诱导细胞凋亡不会对机体正常细胞造成损害，也不会导致炎症的发生，是一种不同于细胞坏死的良性自杀行为[26]。因此，通过细胞凋亡的途径来判断药物对肝癌细胞凋亡的影响是筛选抗肝癌药物的一个重要方法。此外，肝癌的难以治愈不仅表现在癌细胞的无限制生长，容易躲避免疫细胞的杀伤；也表现在可能转移到身体其他部位定位生长而生成转移瘤；因此，在抑制肿瘤生长、促使癌细胞凋亡的同时，限制癌细胞的侵袭和转移显得格外的重要。

本课题以人HepG2肝癌细胞株为主要研究对象，初步研究了穿心莲内酯对其增殖、凋亡和迁移的影响。研究结果表明，穿心莲内酯能抑制HepG2肝癌细胞的增殖活性，且对药物质量分数和作用时间有依赖性；对HepG2肝癌细胞的凋亡有促进作用；能抑制HepG2肝癌细胞的迁移。此为穿心莲内酯治疗肝癌的机制研究提供了新思路、新方法，同时也为后续的作用机制研究提供更可靠的依据。