microRNA-335-5p通过靶向WISP3对软骨细胞产生影响

黄殿华 李煜 陈顺有 潘源城 林然 卢育南

（厦门大学附属福州第二医院，福建医科大学第三临床医学院，福建医科福建省创伤骨科急救与康复临床医学研究中心，福州市创伤医学中心，福州 350007）

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种最常见的肌肉骨骼疾病，具有复杂、多因素的特点，主要表现为关节软骨的退化、骨赘形成、滑膜炎症和其他关节组织的病理改变[1-2]。研究表明，microRNAs（miRNAs，miRs）能够通过靶向成骨负性调节因子或靶向成骨因子来调节骨形成[3]。microRNA-335-5p作为一种重要的microRNA被广泛应用于各种细胞过程中，不仅在肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭等起关键作用，其也已被许多研究报道能够调节骨髓间充质干细胞的成骨和软骨形成及分化[4-6]。与正常软骨相比，在OA患者的软骨中microRNA-335-5p表达显著上调[7]。有研究报道，WISP3（Wnt1诱导信号通路蛋白-3，CCN6）作为人出生后正常的骨骼生长和软骨稳定是必不可少的基因之一[8-9]。其能够促进软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）和蛋白多糖（Aggrecan，ACAN）的表达，并调节基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表达[10-12]。而在OA发病过程中，细胞外基质中CollagenⅡ及ACAN的含量减少，在我们先前研究中已证实在microRNA-335-5p过表达抑制软骨细胞中CollagenⅡ及ACAN的mRNA表达及蛋白含量且促进MMP13的mRNA表达及蛋白含量。但microRNA-335-5p与WISP3之间的相关性仍未明确。本研究通过过表达和抑制microRNA-335-5p，并进行一系列体外实验，多角度地阐明microRNA-335-5p在软骨细胞中的作用机制及其与WISP3之间的关系，为OA新的治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠软骨细胞购自于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。

1.2 试剂

1.2.1 质粒 microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor及inhibitor NC质粒购自上海吉玛（Sigma）公司。见表1。

表1 microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor及inhibitor NC质粒序列

1.2.2 实验试剂 胎牛血清（Gibco，USA）；DMEM低糖培养基（Hyclone，USA）；青霉素-链霉素溶液（Hyclone，USA）；Ⅱ型胶原酶（Roche，Switzerland）；胰蛋白酶（Roche，Switzerland）；lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）；microRNA快速提取试剂盒（Aidlab，CHINA）；MiRNA RT/qPCR Detection Kit（Aidlab，CHINA）；逆转录试剂盒（Vazyme，CHINA）；SYBR Green Master试剂盒（Vazyme，CHINA）；U6、microRNA-335-5p、GAPDH、WISP3引物（Sigma，CHINA）；RIPA buffer（Boster，USA）；5×loading buffer（Boster，USA）；Western封闭液（Boster，USA）；WISP3一抗（Abcam，UK）；β-actin一抗（proteintech，USA）；二抗（proteintech，USA）。

1.3 实验方法

1.3.1 软骨细胞的培养与处理 小鼠软骨细胞细胞用含10%胎牛血清的iCell原代软骨细胞基础培养基培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养，之后2～3 d换液1次。待细胞生长汇合度至培养瓶的90%时按1∶（2～3）进行传代。

1.3.2 miR-335-5p转染 转染前将细胞接种至6孔板，待细胞长到70%～90%，根据lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）说明书将microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor及inhibitor NC质粒分别转染至软骨细胞。转染前一天更换不含双抗的培养基，转染6 h后换液，通过荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白的表达，估算转染效率。

1.3.3 RNA提取及qRT-PCR 转染后24 h，用microRNA快速提取试剂盒（Aidlab，CHINA）从各组软骨细胞中提取miRNA，MiRNA RT/qPCR Detection Kit（Aidlab，CHINA）进行逆转录，上机分析miRNA的表达，逆转录条件为：42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。Trizol法提取各组总RNA，按逆转录试剂盒（Vazyme，CHINA）说明书逆转录获得cDNA，逆转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min。根据SYBR Green Master试剂盒（Vazyme，CHINA）说明书进行加样操作，并上机分析WISP3的表达。采用2－ΔΔCt法分析实验结果。U6和GAPDH分别用作miRNA和mRNA检测的内参。各引物序列见表2。

表2 GAPDH、WISP3、U6、microRNA-335-5p引物序列

1.3.4 Western Blotting 转染48 h后，使用RIPA buffer（Boster，USA）提取各组软骨细胞的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将各组蛋白样品加入其体积1/4的loading buffer（Boster，USA），100 ℃金属浴变性5 min。以30 μg蛋白量上样行8% SDS-PAGE分离蛋白，分离条件：20 V 20 min，80 V 30 min，120 V 60 min。半干转法进行转膜。用western封闭液（Boster，USA）封闭1.5 h，WISP3、β-actin一抗4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h。TBST漂洗3次，每次10 min，通过经典电化学发光法（ECL）显影目的蛋白。

1.4 统计学方法 数据使用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。两组间采用两独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率 转染6 h后荧光显微镜下观察细胞形态及荧光蛋白的表达，转染效率达80%（图1）。转染后24 h，提取miRNA，检测microRNA-335-5p的表达，结果显示：mimics组高于mimics NC组，inhibitor组低于inhibitor NC组（图2），表示转染成功。

图1 miR-335-5p转染6 h后，荧光显微镜观察细胞形态及荧光强度观察，转染率约为80%

图2 各转染组中miR-335-5p表达水平变化

2.2 microRNA-335-5p对WISP3的mRNA表达的调节作用 转染24 h后，mRNA的检测结果显示：microRNA-335-5p过表达显著下调了WISP3的mRNA表达水平，相反，microRNA-335-5p低表达显著上调WISP3的mRNA表达水平（图3）。表明microRNA-335-5p能够抑制WISP3的mRNA合成（P＜0.05）。

图3 qRT-PCR检测各组转染miR-335-5p mimcs和inhibitor对WISP3的mRNA表达水平的影响

2.3 microRNA-335-5p对WISP3蛋白表达的调节作用 转染48 h后，收集细胞，Western Blotting检测各组WISP3蛋白的表达水平。结果显示：microRNA-335-5p过表达显著下调了WISP3的蛋白表达水平，mimics组的蛋白表达量为mimics NC组0.87倍。相反，microRNA-335-5p低表达显著上调WISP3的蛋白表达水平，inhibitor组的蛋白表达量为inhibitor NC组的1.32倍（P＜0.05）（图4）。表明microRNA-335-5p能够抑制WISP3的蛋白合成。

3 讨论

microRNAs是一种小的非编码RNA分子，长19～23个核苷酸[7]。通过完全互补或不完全碱基对结合到同源信使RNA（MRNAs）的3'-非翻译区（3'-UTR），从而抑制翻译或降低稳定性，可以直接抑制靶基因的表达，在基因表达的转录和转录后调控中起着重要作用[13-14]。高度特异的miRNA表达模式与发育和心血管疾病以及组织的改变等疾病有关，其基因调控在细胞的基本功能、软骨和骨的发育中起着重要的作用，被证明是人类癌症的预后和诊断生物标志物[1,15]。microRNA-335-5p作为microRNAs中的一员，在肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭等起关键作用，在多种实体肿瘤中有差异性表达，也被许多研究报道能够调节骨髓间充质干细胞的成骨和软骨形成及分化[13,16]。Zhang等[17]在小鼠的成骨细胞中过表达microRNA-335-5p，表明microRNA-335-5p在成骨细胞系中的过表达诱导了小鼠成骨分化和骨形成。Kopańska等[7]指出在OA患者的软骨组织中microRNA-335-5p表达明显增高。在我们先前研究中已证实在microRNA-335-5p过表达软骨细胞中CollagenⅡ及ACAN的mRNA表达及蛋白含量均受到抑制，且促进MMP13的mRNA表达及蛋白含量。但关于其对软骨细胞及成骨细胞的作用机制仍然不明确。何伟珍等[18]指出microRNA-335-5p通过直接靶向DKK1的3'-UTR抑制DKK1表达及调节Wnt信号通络，调节成骨分化。也有研究指出microRNA-335-5p具有靶向和调节Osterix和RUNX 2在骨中的作用，从而诱导成骨细胞的分化和骨形成[3,19]。

WISP3属于CCN家族，是一种分泌的富含半胱氨酸的高度保守的基质细胞蛋白（36.9kDa），位于第6q21-22染色体上，既能在细胞内发挥作用，又能在细胞外发挥作用，参与多种发育效应的调控[20-22]。此外，CCN蛋白还参与细胞增殖、迁移、伤口愈合、血管生成和肿瘤发生等基本生物学过程。近年来，WISP3已被报道在乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等癌症中都有不同程度的表达[23-25]。与WISP3突变相关的疾病研究表明，WISP3是骨骼生长和保持软骨完整性所必需的基因[9,26]。Liu等[27]通过促进WISP3突变谱的进一步扩展，论证了WISP3基因突变与脊椎骨骺迟缓性发育不良伴进行性关节病（SEDT-PA）之间的相关性。研究表明，在进行性假性类风湿发育不良症（PPD）中，WISP3基因存在纯合子核苷酸缺失，其与软骨丢失和骨骼发育受限有关[28-29]。WISP3主要通过调节Collagen Ⅱ的表达来维持软骨完整性，其能上调人软骨细胞Collagen Ⅱ及ACAN的表达，并抑制IGF-IR、IRS-1和ERK激酶的活化，表明WISP3可能是一种促进软骨合成途径的潜在刺激因子。

microRNA-335-5p及WISP3对软骨细胞形态改变均有影响，但是目前没有文献报道二者之间是否具有相关性。鉴于OA患者关节软骨的严重变性以及microRNA-335-5p和WISP3对软骨细胞中Collagen Ⅱ及ACAN表达的不同影响，我们认为microRNA-335-5p可能通过调节WISP3的表达进而影响Collagen Ⅱ及ACAN表达，最终导致OA的形成。我们通过将microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC分别转染至软骨细胞，利用qRT-PCR和Western Blotting分别检测各组WISP3的表达情况。结果发现microRNA-335-5p能够抑制WISP3的mRNA转录及蛋白合成，而WISP3能够促进软骨细胞中Collagen Ⅱ及ACAN的表达，是保持软骨完整性所必需的蛋白。因此我们认为microRNA-335-5p可能通过抑制WISP3的表达来抑制软骨细胞外基质中CollagenⅡ及ACAN的合成，从而导致软骨再生障碍，最终导致OA的发生及发展。

总之，我们研究表明microRNA-335-5p能够抑制软骨细胞中WISP3的mRNA转录及蛋白合成，破坏了软骨的完整性。因此microRNA-335-5p与OA发展具有相关性，对其有潜在的推进作用。为OA的治疗提供了新的靶点和研究方向。但microRNA-335-5p是否直接靶向调节WISP3，进而影响软骨细胞外基质中Collagen Ⅱ及ACAN的表达，将是我们接下来研究的重点。