基于λ核酸外切酶辅助的级联型铜离子荧光检测体系的构建

刘 陈,刘金权,郦瑜杰,廖力夫,肖锡林*

(1.南华大学 化学化工学院,湖南 衡阳421001;2.南华大学 衡阳医学院公共卫生学院 典型环境污染与健康危害湖南省重点实验室,湖南 衡阳421001;3.南华大学 资源环境与安全工程学院,湖南 衡阳421001)

0 引 言

铜作为人体必需的过渡重金属之一，在人体的多种涉及金属酶的基本生理过程中起着非常重要的作用[1-3]。但是，高浓度的铜离子(Cu2+)会对人体的神经系统和肝脏造成严重损伤[4-6]。因此，开发一种简便、灵敏的Cu2+监测方法对人类健康具有重要意义[7-9]。到目前为止，原子吸收光谱(atomic absorption spectroscopy,AAS)[10]、表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)[11]、电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[12]等传统分析策略已成为高灵敏检测Cu2+的最常用方法，但这些方法通常需要精密的仪器、繁琐的样品前处理和严格的操作环境等，这大大限制了他们的应用范围。因此，开发一种灵敏、高选择性且简便的用来检测环境和生物样品中Cu2+的高效方法显得至关重要。

脱氧核酶(deoxyribozymes，DNAzymes)是一种通过体外筛选技术筛选出来的双链功能核酸，且在某些作为辅助因子的金属离子的存在下，具有高效的催化性能和结构鉴定功能[13-15]。由于Breaker分离出的依赖于Cu2+的DNAzyme(Cu2+-DNAzyme)制备方法简单[16]，且在恶劣条件下具有良好的稳定性，因此该Cu2+-DNAzyme被认为是识别Cu2+的理想平台[17-19]。此外，将其与荧光法[20-21]，电化学法[22-23]，比色法[24-25]等技术相结合，可以制备多种DNAzymes生物传感器，实现了对铜离子的高效检测。其中，荧光DNAzymes生物传感器因其操作简单、灵敏度高、检测效果明显且效果稳定等优点已得到广泛应用[26]。为了检测更低浓度的Cu2+，高灵敏的荧光DNAzymes生物传感器通常需要将作为信号转导的DNA片段进行扩增[27]。

等温扩增策略是一种简单、高效的核酸序列扩增技术[28-30]，它可以在恒温条件下有效地扩增特定序列，并在DNAzymes生物传感器中有效实现了信号扩增[31-33]。目前，已有大量的等温扩增技术被开发，如基于核酸酶的信号扩增[34-36]、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)[37-39]和催化发夹自组装(catalytic hairpin self-assembly,CHA)[40-42]等。其中，基于核酸酶的信号扩增在DNAzymes生物传感器中已得到了广泛应用[43-45]。作为常用核酸酶之一的λ核酸外切酶(λ exonuclease,λ-exo)，能够催化双链DNA分子从磷酸标记的5′端至3′端方向逐步水解，将双链DNA水解成单链DNA[46-48]。因此，λ-exo为靶循环扩增提供了一个通用的检测平台[49-51]。此外，作为一种无酶等温信号扩增技术，CHA能在触发链DNA链的存在下，实现高特异性的靶标循环扩增[52-54]。

为实现对低浓度Cu2+的高效检测，首次将上诉两种信号循环扩增反应用于级联信号放大，设计了一种基于Cu2+-DNAzyme和级联型双循环信号放大策略的Cu2+荧光检测体系。通过这种级联信号放大策略且在某一低浓度Cu2+的范围内，荧光信号的强度与Cu2+的浓度成正比，在高灵敏、高选择性的Cu2+检测过程中体现出了广阔的应用前景。

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

仪器：Hitachi F-7000荧光光谱仪(日本日立公司)，PHS-3E型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，水浴锅(江苏常州金坛区西城新瑞仪器厂)，旋涡混合器XW-80A。

试剂：所有DNA片段均由通用生物(安徽)股份有限公司提供(序列见表1)，λ-exo(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，硝酸铜(Cu(NO3)2,广州化学试剂厂)、抗坏血酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、磷酸氢二钠(Na2HPO4，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、盐酸(衡阳开心化学试剂有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA，广东汕头新宁化工厂)、氯化钠(NaCl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、无水氯化镁(MgCl2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)等均为分析纯级别，实验用水为18.2 MΩ·cm的超纯水。

表1 本研究用到的DNA序列

1.2 级联型铜离子荧光检测体系的构建

1)试剂的准备

Cu2+-DNAzyme溶液的制备:根据文献[55]，将酶链DNA(E-DNA)和底物链DNA(S-DNA)分别溶于缓冲液A(50 mmol/L Na2HPO4,pH=7.4)中以制备各自的储备液(10 μmol/L);然后，将等量的E-DNA溶液和S-DNA溶液混合，并在95 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至室温以形成稳定的Cu2+-DNAzyme。

TQ-DNA溶液的制备：首先，将TDNA和QDNA分别溶于缓冲液B(25 mmol/L Tris-HCl,0.1 mol/L NaCl,15 mmol/L MgCl2，pH=7.4)中以制备各自的储备液(10 μmol/L)；然后，将等量的TDNA溶液和QDNA溶液混合，并在95 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至室温以形成稳定的TQ-DNA。

发夹DNA(H1/H2)溶液的制备：将发夹DNA(H1/H2)溶于缓冲液C(50 mmol/L Na2HPO4,0.5 mol/L NaCl,pH=7.4)中，然后在95 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至室温形成稳定的发夹DNA。

2)铜离子的检测

首先，取7.5 μL不同浓度的铜离子、2.5 μL抗坏血酸(5 mmol/L)和3 μL DNAzyme(5 μmol/L)与37 μL缓冲液A混合，并在室温下反应30 min；然后，取20 μL上述反应液与6 μL TQ-DNA溶液混合，且在室温下反应30 min；此时，在该反应液中加入3 μL λ-exo和46 μL λ-exo缓冲液，并且在37 ℃下反应1 h；随后，在上述酶切反应液中加入3 μL H1、3 μL H2和219 μL缓冲液D(50 mmol/L Na2HPO4,1 mmol/L EDTA,pH=7.4)，且在37 ℃下反应1 h。最后在室温下立即测量样品的荧光光谱图。

1.3 荧光测定

荧光测量均使用光程为1 cm的比色皿。电压设置为700 V，狭缝宽度设为5 nm×5 nm，扫描速度为1 200 nm/min。测定样品溶液在485 nm处的相对荧光强度ΔF。每个样品均平行测定3次。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

实验原理图如图1所示，实验体系包括5个部分：不加待测物Cu2+的检测反应、完整的检测反应、不加H2的检测反应、不加λ-exo的检测反应以及单独的CHA部分。就完整的检测反应而言，首先，在待测物铜离子的存在下，Cu2+-DNAzyme被特异性切割，释放出短的DNA片段tDNA。随后，释放出的tDNA与TQ-DNA在室温下杂交，形成稳定的可被λ-exo识别并切割的双链DNA。由于λ-exo可作用于5′磷酸化的双链TQ-DNA，并沿5′-3′方向渐进性催化去除5′单核苷酸、破坏TQ-DNA结构，同时释放出tDNA和TDNA。游离的tDNA可被回收用于新一轮的DNA分子杂交反应。此外，游离的TDNA作为辅助链触发后续的催化发夹自组装(CHA)反应，生成H1/H2双链产物并伴随有强荧光信号，同时，TDNA被置换下来作为新一轮CHA的辅助链。上述基于双循环的级联信号放大策略，能有效实现荧光信号的放大，并且产生的荧光信号与Cu2+的浓度在一定范围内成正比，可有效实现铜离子的定量分析检测。

图1 级联型铜离子荧光检测体系示意图

2.2 可行性研究

不同条件下的荧光光谱表明，在无目标物和有目标物时，两者的荧光强度具有明显的变化(见图2)。

图2 不同反应阶段的荧光光谱

2.3 测定条件的优化

2.3.1 CHA中错配碱基个数的优化

在本实验中，作为荧光信号响应的CHA部分决定了荧光信号输出的灵敏度。故首先对CHA进行了优化。在CHA中，为了减少两个发夹DNA因非特异性结合而产生的背景信号，往往需要对其中一个发夹DNA的部分碱基进行错配。本实验对参加CHA反应的发夹DNA H2的部分碱基进行了错配，并对其错配碱基数进行了优化(如图3)。实验结果表明，H2的错配碱基数从0逐渐增加到3时，荧光输出的信噪比呈现出先增加后减少的趋势，且在碱基错配数为1时达到最大值。故最终选择碱基错配数为1的H2来降低CHA的背景信号。

图3 H2碱基错配的数目对反应催化发夹自组装反应信噪比的影响

2.3.2 CHA反应温度的优化

由于CHA反应的温度能影响其反应中的背景信号大小，进而影响级联反应体系的灵敏度，因此本实验考察了CHA反应温度对体系荧光强度的影响(如图4)。结果表明，随着CHA反应温度的增加，CHA的信噪比逐渐增大，且在温度为37 ℃时信噪比达到最大。故选择37 ℃作为CHA反应的最佳温度。

图4 反应温度对催化发夹自组装反应信噪比的影响

2.3.3 TQ-DNA退火缓冲液中镁离子浓度的优化

为了使酶切体系的背景信号尽可能小，通常需要使经5′磷酸标记的TQ-DNA双链尽可能稳定。本实验通过使用含有不同浓度镁离子的退火缓冲液对TQ-DNA双链进行退火处理，获得了性能更稳定的双链DNA(见图5)。结果表明，随着退火缓冲液中镁离子浓度的增加，酶切体系的信噪比逐渐增大，且当退火缓冲液中的镁离子浓度为15 mmol/L时，酶切体系的信噪比达到最大。

图5 TQ-DNA退火缓冲液中镁离子浓度对反应信噪比的影响

2.3.4 λ-exo反应温度的优化

温度对酶切反应背景信号的大小同样起着至关重要的作用。通过探究在不同温度下酶切反应的切割效果，确定了最佳的酶切反应温度。如图6所示，随着酶切反应温度的增加，反应体系的信噪比逐渐增大，且在37 ℃时，酶切反应的信噪比达到最大，此时的检测性能最佳。故选择37 ℃作为酶切反应的最佳反应温度。

图6 λ核酸外切酶的反应温度对反应信噪比的影响

3 结 论

综上所述，本实验成功构建了一种用于超灵敏检测Cu2+的级联型荧光检测体系。用荧光光谱法对该体系不同反应阶段进行了表征。基于λ-exo和CHA的级联反应体系能有效地降低检测体系的背景信号。此外，基于λ-exo与CHA的双重靶循环信号扩增能有效增加输出的荧光信号强度，可大大提高检测体系的灵敏度。实验结果表明，该级联型铜离子荧光检测体系的构建和性能已达到预期效果。其实际应用还有待进一步的研究。