ROCK信号通路对高糖诱导血管平滑肌细胞炎症反应的调控作用及其与Nur77表达的关系

郭利艳，刘达，陈利侠，魏梅，刘刚，郑明奇

河北医科大学第一医院心血管内科，石家庄 050000

动脉粥样硬化（AS）是一种以动脉壁内炎症和脂质沉积为特征的慢性多因素疾病，典型的AS病灶为粥样硬化斑块，斑块糜烂及斑块破裂后造成的血栓形成是临床心血管事件发生的主要原因之一，而不稳定斑块具有脂质坏死核心较大、大量炎症细胞浸润及纤维帽较薄等特点［1-2］。血管平滑肌细胞（VSMC）位于血管中膜，是血管壁的重要组成部分［3］。研究表明，VSMC 可发生表型转化，转化为巨噬细胞样细胞、泡沫细胞、间充质干细胞、成骨样细胞等多种类型，进而影响斑块稳定性。VSMC 可通过多种方式参与血管炎症的级联反应，既可以产生促炎症细胞因子促进炎症细胞向血管壁募集，也可以被其他细胞分泌的炎症因子所调控，而血管炎症的级联放大可破坏AS 斑块的稳定性，促进斑块破裂［4］。ROCK 是Rhos 相关丝氨酸/苏氨酸激酶家族的 一 员，是RhoA 和RhoC 激 活 的 下 游 效 应 物［5］。ROCK 信号通路参与了多种心血管疾病的发病，与AS、高血压、冠状动脉痉挛等心血管疾病的发生发展关系密切。法舒地尔是一种ROCK 信号通路抑制剂，主要应用于心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤的治疗。既往研究重点主要是ROCK 信号通路对VSMC 增殖、迁移能力的影响，而其对VSMC 炎症反应的研究甚少［6］。孤儿核受体Nur77 被认为是调控AS发生发展的关键转录因子之一，具有一定的抗炎作用。2020 年1 月—2021 年12 月，本研究观察了ROCK 信号通路及Nur77 表达对高糖诱导VSMC 炎症反应的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：法舒地尔、Nur77 激动剂Cy⁃tosporone B（CsnB）均购自上海MCE公司，青—链霉素双抗溶液、胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，逆转录、qPCR试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；ROCK1抗体、ROCK2抗体、白细胞介素6（IL-6）抗体、山羊抗兔荧光二抗、山羊抗鼠荧光二抗均购自美国Abcam公司，白细胞介素1β（IL-1β）抗体购自南京Bioworld公司，Nur77抗体购自美国Santa Cruze公司，山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗均购自北京Easybio公司，α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体购自美国Cell Signaling 公司，肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体购自南京Affinity公司。引物：Nur77及内参PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。主要仪器：倒置显微镜、荧光显微镜均购自日本Olympus 公司，细胞培养箱、酶标仪均购自美国Thermo公司，PCR仪购自美国应用生物系统公司。

1.2 大鼠VSMC 的提取、培养及鉴定 采用组织贴块法。选取体质量为120～150 g 的健康雄性SD大鼠20 只，分离、提取主动脉，剪成0.5～1 mm3的组织块，均匀平铺于培养瓶底部，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中开始原代培养。保持培养皿绝对静置，约3 d 后细胞开始爬出，约5 d 后细胞开始融合。对VSMC 进行平滑肌特异性蛋白α-SMA 免疫荧光染色，荧光显微镜下观察染色情况。结果显示：细胞核在Hoechst 染色液复染后呈蓝色，95%以上的细胞呈强阳性染色，细胞质内可见大量绿色荧光，即α-SMA，说明分离出的VSMC 纯度较高。见OSID 码图1。

1.3 细胞分组处理 取原代VSMC，每2～3 d 换一次液，在显微镜下观察细胞形态与数目，当细胞铺满瓶底90%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例进行传代培养。取3～4 代处于对数生长期的VSMC，待细胞密度达80%时，换用无血清培养基饥饿培养24 h，使细胞处于静止期。将细胞分为对照组、法舒地尔组、高糖组、高糖+法舒地尔组，分别加入葡萄糖5.5 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L+法舒地尔50 µmol/L、葡萄糖30 mmol/L、葡萄糖30 mmol/L+法舒地尔50µmol/L，作用12 h。

1.4 细胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6、Nur77 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。提取各组细胞总蛋白，加上样缓冲液煮沸5 min使蛋白变性。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将蛋白转印至PVDF 膜，5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h。加入ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6、Nur77 及内参β-actin 一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次，加入相应的二抗（稀释比例均为1∶2 000），孵育1 h。TBST 洗膜3 次，ECL 化学发光液显影，Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参β-actin 条带灰度值的比值计算目的蛋白相对表达量。

1.5 细胞Nur77 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。采用TRIzol 试剂提取各组细胞总RNA，检测RNA 纯度和浓度合格后，按照反转录试剂说明书配置反转录体系，反转录成cDNA。根据qPCR 试剂说明书，配制PCR 反应体系。PCR 反应体系：2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0µL、Primer 1（10µM）0.4µL、Primer 2（10µM）0.4 µL、cDNA 2 µL，加入ddH2O 至20 µL。PCR 反应过程：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循 环40 次。Nur77 引物序 列：上游 引 物5′-AGAAGGATTGCAGAGCGCACG-3′、下游引物5′-TT⁃GCTGAACTCAAGGGCCAGG-3′，内参β-actin引物序列：上游引物5′- GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′、下 游 引 物5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。采用2－ΔΔCt法计算Nur77 mRNA相对表达量。

1.6 高糖作用下Nur77 过表达VSMC 中IL-1β、IL-6表达检测 将VSMC 随机分为Nur77 高表达组和空白组，两组均加入葡萄糖5.5 mmol/L，Nur77 高表达组同时加入CsnB 10 µg/mL，作用12 h 后参照1.4、1.5的方法检测Nur77 mRNA 及蛋白表达；两组均更换培养基，加入葡萄糖30 mmol/L，作用12 h 后检测Nur77及IL-1β、IL-6蛋白表达。

1.7 统计学方法 采用GraphPad 8.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6 蛋白表达比较 高糖组细胞ROCK1、IL-1β、IL-6 蛋白相对表达量均高于对照组（P均<0.05）。对照组、高糖+法舒地尔组、法舒地尔组细胞ROCK1、IL-1β、IL-6蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。各组细胞ROCK2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1。

表1 各组细胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6蛋白表达比较（±s）

表1 各组细胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与高糖组比较，#P<0.05。

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图1 各组细胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6、Nur77蛋白表达（Western blotting法）

2.2 各组细胞Nur77 mRNA 及蛋白表达比较 高糖组细胞Nur77 mRNA 及蛋白相对表达量均高于高糖+法舒地尔组、对照组、法舒地尔组（P均<0.05），高糖+法舒地尔组、对照组、法舒地尔组比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。见表2。

表2 各组细胞Nur77 mRNA及蛋白表达比较（±s）

表2 各组细胞Nur77 mRNA及蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与高糖组比较，#P<0.05。

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2.3 高糖作用下Nur77 过表达VSMC 中IL-1β、IL-6表达变化 低糖环境下空白组和Nur77 高表达组Nur77 mRNA相对表达量分别为0.27±0.06、0.73±0.05，Nur77 蛋白相对表达量分别为0.23 ± 0.05、0.63±0.07，两组比较P均<0.01；加入高糖后空白组和Nur77 高表达组Nur77 蛋白相对表达量分别为0.57±0.38、0.82±0.04，IL-1β蛋白相对表达量分别为0.56±0.08、0.17±0.05，IL-6蛋白相对表达量分别为0.72±0.06、0.24±0.06，两组比较P均<0.01。

3 讨论

AS 是一种炎症性疾病，炎症反应贯穿AS 发病的整个过程，VSMC 在AS 的形成和进展中发挥着重要作用［7］。VSMC 产生的炎症因子可促进血管炎症反应、破坏AS斑块稳定性，从而促进斑块破裂，其具体的作用机制包括：①血管炎症可激活血管内皮细胞，促进黏附分子表达及血管通透性增加，从而募集大量的炎症细胞及脂质成分，致使AS斑块脂质核心增大；②血管炎症亦可抑制斑块纤维帽平滑肌细胞增殖及胶原纤维合成；③血管炎症还可诱发血管痉挛，改变斑块处的力学特性，进而破坏AS 斑块的稳定性。因此，充分了解VSMC 在AS 过程中的作用对于确定预防和治疗AS 的治疗靶点至关重要。研究显示，长期持续性高血糖可致血管、心脏、肾等发生慢性损害，VSMC 在高糖状态下表型发生改变，炎症反应增强，因此高糖状态会加剧AS 的进展［8-10］。本研究结果显示，高糖作用后VSMC 中的IL-1β、IL-6蛋白表达升高，证明高糖可以引起血管炎症反应，加剧AS进展。

ROCK 是Rho GTPases 的一种效应蛋白，可磷酸化一系列下游靶标，并在细胞收缩、迁移和肌动蛋白细胞骨架组织等各种细胞功能中发挥关键作用［11-13］。ROCK 信号通路作为信号“转换器”或“分子开关”作用于细胞或其靶蛋白后，可诱发细胞增殖、迁移、黏附和炎症反应等。目前已经鉴定出两种ROCK亚型，ROCK1和ROCK2。ROCK1主要存在于非神经组织，如肺、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸等组织；ROCK2 主要存在于脑组织，但两者在心脏和血管平滑肌上均有表达［14］。本研究结果表明，高糖作用后VSMC 中的ROCK 信号通路激活，从而引起VSMC 炎症反应；加入ROCK 抑制剂法舒地尔可显著降低高糖作用后VSMC 中的ROCK1 及IL-1β、IL-6 蛋白表达，提示可以减轻炎症反应；在没有高糖刺激的情况下，单独抑制ROCK 信号通路对VSMC 的炎症反应没有显著效应，可能是因为在没有高糖刺激的环境下ROCK 表达较低。ROCK1 和ROCK2 均可参与高糖介导的VSMC 炎症反应，但发挥作用的程度可能不一样，ROCK1 参与高糖介导的VSMC 炎症反应更显著，这可能与ROCK1 在非神经元组织中表达较高，而ROCK2优先表达于大脑组织有关。

孤儿核受体是一类尚未发现特异性配体的核受体，可被多种细胞内外刺激因素如炎症、细胞因子、应激反应、肽类激素等快速诱导［15］。孤儿核受体中的Nur77 目前研究较为广泛，被认为是调控AS 发生发展的关键转录因子之一，也是调控炎症反应的下游 蛋 白 之 一［16］。CsnB 是Nur77 激 动 剂，通 过 与Nur77的配体结合域结合，可特异性刺激Nur77的转录活性，而Nur77 在多种心血管疾病（如血管重塑、AS、心脏肥大和心脏缺血再灌注损伤）的发病机制中起关键作用［17］。在VSMC中，Nur77可被多种刺激诱导，包括细胞因子、生长因子、炎症因子、氧化低密度脂蛋白和血管损伤［18］。既往体内研究表明，炎症性肠病患者和结肠炎小鼠结肠组织中Nur77 表达均显著降低，而Nur77 缺乏会导致小鼠结肠炎病情加剧［19］。研究显示，Nur77 可通过抑制NF-κB/p65 转录活性以抵消炎症反应，发挥抗炎作用，敲低Nur77表达则表现出相反的作用［20-21］。本研究结果显示，VSMC 在低糖环境下加入CsnB 可引起Nur77 表达显著升高，改换高糖后Nur77 表达还是升高的，而IL-1β、IL-6 蛋白表达均下降；提示Nur77 能够抑制炎症反应，对炎症反应具有负反馈调控作用，即Nur77 具有抗炎作用。但在本研究中对照组与法舒地尔组Nur77 mRNA 及蛋白相对表达量比较无统计学差异，可能与对照组及法舒地尔组VSMC 炎症因子水平较低，均未能诱导Nur77 mRNA 及蛋白表达升高有关。本研究高糖组Nur77 mRNA 及蛋白相对表达量均高于高糖+法舒地尔组，分析原因可能为VSMC在高糖环境中加入ROCK 抑制剂后的炎症因子被抑制，因此不能刺激Nur77 高表达，或Nur77 表达处于上升期还没有到达抑制炎症的节点。

综上所述，阻断ROCK 信号通路和上调Nur77表达均可抑制高糖诱导的VSMC 炎症反应。ROCK信号通路是引发炎症反应的上游通路，而Nur77 是炎症反应发生后引起反应的下游蛋白，既往鲜见ROCK信号通路与Nur77表达之间调控关系的研究，本研究提示ROCK 信号通路与Nur77 表达之间可能存在某种调控关系，这正是文章的创新点，但其具体的调控关系尚不清楚，需要进一步研究证实，同时也为以后更进一步研究提供新的方向。本研究证明Nur77 可能是调节AS 斑块形成的重要核激素受体，为预防和治疗AS 的新药开发提供了新的靶点和研究方向。